游離DNA的發現讓腫瘤檢測大不同

　　自從在血液中循環的DNA被發現以來，那些來自惡性腫瘤的游離DNA（cell-free DNA，簡稱cfDNA）就引起了科學家的極大興趣。近年來，圍繞游離DNA的一些挑戰正逐漸被攻破，而這些研究成果也正逐步轉化為臨床應用。GEN網站近日介紹了這些進展。

　　哈佛大學醫學院的助理教授Geoffrey R. Oxnard表示：“游離DNA穩定，容易采集，也容易分析，但我們還在研究它包含什么。”Oxnard博士及其同事開發出一種策略，以區分非小細胞肺癌患者的EGFR T790M突變是來自生殖細胞，還是來自腫瘤。

　　cfDNA是一種復雜的混合物，包含良性細胞、白細胞和病毒的核酸，而腫瘤DNA似乎只占了一小部分。Oxnard博士的研究結果發現，絕大多數游離DNA是來自生殖細胞。“我們得到的啟示是，我們還不清楚液體活檢究竟是檢什么，目前還需要大量的工作，才能開發出真正影響治愈率的檢測。”

　　對cfDNA分子變化的研究，離不開各種生物學技術。Oxnard博士認為：“對于明確的問題，比如尋找EGFR耐藥突變，數字PCR是一種經濟有效且可擴展的方法，讓我們能夠研究許多標本。”其他的探索性問題則需要廣泛的平臺，如新一代測序（NGS）。

　　TEC-seq測序技術

　　約翰霍普金斯醫學院的研究人員開發出一種不同的方法，對cfDNA進行早期檢測。據腫瘤學教授Victor E. Velculescu介紹，這是一種廣泛適用的方法，對許多類型的癌癥都有效。今年8月，這項成果發表在《科學轉化醫學》雜志上。

　　研究人員對200名結直腸癌、乳腺癌、肺癌或卵巢癌的患者以及44名健康個體開展液體活檢。他們利用一種稱為靶向錯誤校正測序（TEC-Seq）的超深度測序方法，來評估循環游離DNA中的58個癌癥相關基因。

　　對于138名早期癌癥患者，研究人員在59%到71%的血漿樣本中發現了體細胞突變，而具體比例隨癌癥類型的不同而不同。在大約16%的健康個體中，研究人員發現了與年齡相關的微小變化，但對照組沒有明顯的癌癥相關改變。

　　檢測循環腫瘤DNA中的突變，挑戰在于突變很罕見，且DNA又被稀釋，這使得常規測序方法獲得的信息量很少。于是，Velculescu領導的團隊開發出TEC-seq方法，它從血漿中純化游離DNA，并制備出文庫，用于超深度的測序。“多個分子的多次測序可鑒定出真正的改變，”他說。同時，他們采用的算法可區分多個來源的DNA，包括腫瘤、生殖細胞和血細胞。

　　在cfDNA的分析中，大量工作集中在從各種定性和定量信息中提取臨床和預后信息。“循環腫瘤DNA的存在對診斷非常重要，也有望告知疾病的嚴重程度，”Velculescu博士說。例如，游離的循環腫瘤DNA可能來源于原發性腫瘤，也可能來自未被發現的轉移病灶。

　　研究人員追蹤了31例結直腸癌患者在切除腫瘤后的治療反應和疾病進展。他們表示，手術前循環腫瘤DNA的水平較高往往與總體生存率較差一致。“我們需要對各種類型的癌癥患者開展更大規模的試驗，以證明它的敏感性和特異性與我們觀察到的一致，并且適用于臨床環境，”他們稱。

　　數字PCR檢測

　　數字PCR也是此領域研究人員青睞的技術。據Bio-Rad數字生物學中心的主任George Karlin-Neumann介紹，數字PCR檢測具有高的特異性和敏感性，可檢測一些難以區分的突變，如單核苷酸多態性。

　　在Bio-Rad的微滴式數字PCR中，微滴發生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。這樣，每個微滴都作為一個獨立的PCR反應器。反應在96孔PCR板上進行，之后用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測，根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，計算目標分子的濃度或拷貝數。

　　與實時定量PCR不同，ddPCR不需要標準品，可計算出目標分子的絕對濃度。這樣，研究人員可獲得更精確的測量結果。在實時定量PCR中，抑制劑或未知成分的存在有可能影響PCR的效率，但數字PCR不需要擔心這樣的問題。“它可以更好地耐受擴增效率達不到100%的檢測，”Karlin-Neumann博士說。

　　ddPCR平臺一般在3-4小時內提供第一批結果，而整塊96孔板可在5小時內讀取。它特別適合已知標記物的檢測，或者突變數量相對較少的癌癥。與其他復雜的技術相比，ddPCR顯得更加經濟實惠。

　　Karlin-Neumann博士強調：“目前，液體活檢面臨的挑戰是確定臨床實用性。”過去，人們通常利用CT掃描或其他成像技術來評估患者對治療的反應，或者是對血液中那些不太完美的蛋白標志物進行檢測。

　　正如一些癌癥類型所示，監控血液中的腫瘤DNA似乎能提供腫瘤大小的信息。現在的問題是，從腫瘤DNA中獲得的信息是否能改善臨床結果。“我們希望是這樣，并且有理由相信臨床實用性將體現在治療和報銷上，”Karlin-Neumann博士談道。