抗腫瘤方面細胞實驗心得

養細胞1年多了，走了很多彎路，我從我曾經的疑惑或者犯的錯誤出發講起，能夠讓部分人少走點彎路，那我就知足了。

我之后的實驗方向與細胞實驗基本無關了，所以此時寫點心得也是對自己的總結。

因為多是個人總結的經驗，難免有錯誤，請多見諒；

個人的經驗也離不開曾經別人的指引，需要感謝幫助過我的同學及壇友。
我最初養細胞時，實驗室并沒有儲備課題所涉及的細胞，所以最初籌集細胞占用了較多時間，我首先想講一下細胞的運送；

1、寄運細胞或者接收細胞，都要做好充足的準備;

        如果是讓其它實驗室寄運細胞，或者寄給別人細胞，細胞應該如何處理是主要考慮的問題。假設細胞在途中要經過48小時，那么可以待細胞長到50%的密度時處理細胞，即將細胞培養瓶內加滿培養液，擰緊瓶蓋，用封口膜封緊瓶口；然后將培養瓶放進泡沫盒，用紙或泡沫將盒內空間填滿，使培養瓶不能隨意移動。同時將泡沫盒鉆上幾個孔，使空氣可以流通。

        因此要確定準備好以下物品：透氣的細胞培養瓶；封口膜；足量的培養液；放細胞培養瓶的泡沫盒及填充物；

        除了細胞的處理，還要注意以下幾點：1）提前跟快遞公司人員聯系，要上門取貨（大多快遞公司都可以，順豐確實算是好些；近來覺得韻達速度也很快）2）時間安排（細胞處理盡量安排在下午，因為快遞公司一般來說都是晚上統一發貨，要是早晨處理細胞交給快遞公司，細胞還沒上路呢，就已經在培養箱外待了一天）；

        接收細胞就容易多了，提前準備好細胞培養用耗材及培養用液就可以了，紫外燈先打開，收到細胞將培養瓶中大部分培養液吸掉，留下4-5ML培養液（針對25cm2的培養瓶）；培養一天后，觀察細胞狀態，確實是傳代還是換液。

        總而言之，運送細胞講究兩點：1離開了培養箱要防止被污染2盡量縮短細胞不在培養箱的時間，不然時間過久細胞長滿脫落就沒得救了。

2 要講的是MTT試驗，這個純粹講個人經驗，因為我本身的考慮可能就是錯的，所以非常歡迎提出疑問以及批評指正。

        1）細胞的鋪板：以96孔板為例，做細胞實驗的同學看文獻可能注意到，有較多的文獻中提到細胞接種數量是5000個/孔；最初我也是按照這個數量來鋪板的，實際上這個接種數量偏高；假設給藥時間是48小時，發現空白對照孔中會有細胞無法貼壁，因為太滿了，被擠出來了。如此，則會因為接種密度原因，而不能準確反映細胞的正常生長情況及給藥組作用情況。即使是給藥時間為24小時，仍然會出現類似情況。

        因此，我后期實驗中接種細胞數量為3000-4000，如果是藥物作用48小時，最好是3000cells/每孔，空白對照孔細胞在加MTT前也就剛好長滿，后來才發現別人也很多按照這個數量接種的，只是提醒需要注意，不要盲目的按照5000這個密度，還有的是10000，基本上不靠譜。

        很明顯，接種細胞數量太少也不好，太少的話SD值會很大。

        還有的人根本就不計數，經驗主義，一個25cm2培養瓶細胞長滿鋪一個板；經驗當然是有用的，但在這里就明顯不合理了，剛才提到MTT實驗對細胞的數量要求相對較精確；另外，如果你是鋪幾個板，都這樣做，本來每個培養瓶細胞數差異就不小，因為你傳代時做不到等量，就這樣直接鋪到板上，不同板之間又有各組藥物的對照實驗，那么得出的OD值還可以比較嗎？所以計數是必要的。

        2）給藥：對于水溶性藥物就不講了，只講難溶于水，而且雖然溶于DMSO，但向DMSO加水后也會析出的藥物；有人是這樣做的，在EP管中用DMSO溶解藥物作為母液，然后用細胞培養液將母液梯度稀釋成各個濃度，藥物有析出，成結晶了，可能都沉了，嚴重不均一了，這濃度就沒法衡量了；

這樣做的人，也想過不合理之處，但又沒有查到好的辦法，所以將就著做了，其實差多了，有效的藥物也做成無效的了。

還有一個錯誤容易犯，DMSO母液用培養液稀釋10倍后是不可以作用于細胞的，因為這樣DMSO占的比例是10%，本身毒性就很大；我曾經單獨測過DMSO對細胞的毒性，1%確實基本無影響，但5%以上則是影響特別大。現在做個假設，用DMSO稀釋母液，而非用培養液，在EP管中用DMSO梯度稀釋藥物成各個梯度濃度，然后直接加到含培養液的96孔中，假設96孔中培養液為197微升，那么加藥的體積只能是3微升或者小于3微升。我覺得可以這么做，操作會更麻煩，難度上稍大了點，但不是不能做。對于沒有一點親水基團的藥物，我就是這樣做的。

有些藥物常溫下難溶于水，可能加熱溶解性會很好，由于專業涉及面不同，很多人會忽略這方面。開始做阿霉素時就沒注意到，后來聽企業人員說加熱到55℃可以很好的溶解，按此法溶解效果很好。

另外我認為，對溶劑進行優化是進行難溶性藥物實驗要學習的一個方面，找到加水后藥物不析出的藥物溶劑，可以是有機溶劑，也可以是制劑中用到的輔料；對于已經上市的用于注射劑的陽性對照藥，肯定有辦法，像頂頂大名的紫杉醇，其實就是用吐溫80和乙醇。

3 細胞的消化前幾天到學院路玩，兩個人說到養細胞，一個說是細胞養的越久越容易消化，另一個說是細胞養的越久越難消化；誰說的對，我不確定；但多數人消化沒有一慣的按照同樣的方法進行消化細胞，主要說兩個因素：胰酶的活性（胰酶的品牌及已經使用的時間，反復凍融的次數等），消化的溫度（包括加入胰酶液的溫度和培養器皿外環境的溫度）。

為了保持一慣性，建議如下：1是胰酶分裝2胰酶的溫度和環境溫度一慣性

不要小瞧了這般，可能遇到難消化的細胞時，就表現不出自己是個養細胞的人了：都不知道把胰酶融化后多放在37℃幾分鐘，也不知道將將細胞轉移到培養箱消化，也不考慮自己的胰酶已經反復凍融了多次。當然也可能有些人養了一年或兩年細胞，從沒碰到難消化的細胞。
如果這樣也不行，利多卡因（5ml裝利多卡因+7.3mlPBS）方法也是可以用的，當時養RAW264.7中途碰到消化不掉的情況，利多卡因這個方法是院里老師傳授的。其實網上搜也能搜到，但比較麻煩，因為網上可能眾說紛紜，你不可能試了一個又一個。明顯經驗是很重要的，如果沒人帶著做實驗，自己很容易亂放炮，不得要領，這都有體會。

4 懸浮細胞的培養根據常規培養懸浮細胞的教程來看，培養過程要比貼壁細胞容易；我最初拿到K562細胞時，我問及注意事項，其中一個是如何判斷細胞長滿？對方說培養液變黃時就可以換液或者傳代了。我覺得不怎么合理，但又沒有想到好的辦法。開始幾天就這樣養的，同時查找資料尋找更合適的方法。當時沒事喜歡發貼子。通過小木蟲的求助，得到了較滿意的答復，并且按照這個建議一直做下去，發現是挺可行的。
接種密度控制在1-3×10^5cells/ml就可以，有時0.2-0.5×105cells/ml的低密度接種也是可以的，不必把密度接種很高，這樣影響細胞的生長，也增加培養基的消耗和人工。當細胞的密度增加到6-10×10^5cells/ml時（通常用72hrs）就對細胞進行傳代。維持低細胞密度是非常好的辦法。經常計數，是掌握細胞生長規律最好的辦法。
先寫這些，希望大家能夠多多批評指正，共同進步。