實時熒光定量RTPCR的Foldchange怎么計算

3. Real-time qPCR定量方法

可以分為絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標準品可以是純化的質粒DNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分為比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是2-DDCt 。

3.1絕對定量

從標準曲線獲得線性方程：

Y=-3.432X+34.638;R2= 0.995, E=95%，所以可以進行數據分析。

如果未知樣品的 Ct=25，

代入方程： 25=-3.432X+34.638,

所以： X=2.8

Copies=10^2.8

3.22-DDCt定量

2-DDCt方法使用的前提是內參和目的基因的擴增效率接近100%，且相差不超過5%。所用公式如下：

2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]處理組-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]對照組

=2-[E-F]處理組-[A-B]對照組=2(F-B)-(E-A)

比如Cdk5在處理前和處理后樣品中的Ct平均值是25和22.1；內參GAPDH在處理前和處理后樣品中的Ct平均值是18.2和18.3.那么處理所致倍數變化(fold change)應該是

=2-[(22.1-18.3)]處理組-[(25-Ct18.2)]對照組=23=8

也就是處理造成Cdk5表達增加了7倍。

如果是目的基因和內參基因的擴增效率相差比較大，可以用擴增效率進行校正，也就是Pfaffl方法。所用公式如下：

處理所致倍數變化(fold change)= C(A-E)/D(F-B)

擴增效率（E）=10-1/斜率(理想的PCR擴增效率=2)

百分比表示為：e%=(E-1)×100%

同時是上面例子，如果Cdk5的擴增效率是70%；GAPDH的擴增效率是95%，那么處理所致的倍數變化（fold change）應該是

=（1.7）（25-22.1）/(1.95)(18.3-18.2)

=4.36

即處理造成Cdk5表達量增加了3.36倍。