實時熒光定量PCR結果分析，教你從菜鳥到高手

　　實時熒光定量PCR技術(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

　　在對熒光定量PCR結果進行分析時首先要了解幾個概念：

　　基線（Baseline）指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，這樣的直線即基線。

　　光域值threshold的設定，一般將PCR反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR3-15個循環熒光信號標準差的10倍，熒光域值設定在PCR擴增的指數期。

　　CT值表示每個PCR反應管內熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小，反之亦然。

　　融解曲線是用來驗證擴增產物特異性的，如果產物是單一條帶，融解曲線就會出現一尖峰；如果有引物二聚體或其它非特異性擴增，就會出現至少兩個尖峰。

　　Real-Time qPCR 常見問題分析

　　1.無Ct值出現

　　1）檢測熒光信號的步驟有誤：一般SG法采用72℃延伸時采集，Taqman法

　　則一般在退火結束時或延伸結束采集信號；

　　2）引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

　　3）模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；

　　4）模板降解：避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

　　2.Ct 值出現過晚（Ct>38）

　　1）擴增效率低:反應條件不夠優化，設計更好的引物或探針、改用三步法 進行反應、適當降低退火溫度、增加鎂離子濃度等；

　　2）PCR各種反應成分的降解或加樣量不足，

　　3）PCR產物太長：一般采用80-150bp的產物長度。

　　3.標準曲線線性關系不佳

　　1）加樣存在誤差：使得標準品不呈梯度；

　　2）標準品出現降解：應避免標準品反復凍融，或重新制備并稀釋標準品；

　　3）引物或探針不佳：重新設計更好的引物和探針；

　　4）模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

　　4.負對照有信號、溶解曲線不止一個主峰

　　1）引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現；

　　2）引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比；

　　3）鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix 試劑盒；

　　4）模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA 的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

　　5.擴增效率低

　　1）反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解；

　　2）反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法；

　　3）反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板

　　適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

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