如何關閉CRISPR基因組編輯系統中的Cas9

　　 CRISPR/Cas9技術正在如火如荼地發展。形形色色的Cas9變體被開發出，用于基因組編輯，激活和抑制基因表達，以及其他。不過，似乎還少了些什么，Cas9的活性一旦開啟就無法關閉。人們擔心，Cas9在細胞內停留的時間越長，脫靶編輯的可能性也越大。因此，Cas9不僅需要“開”，也需要“關”。

　　幸運的是，多倫多大學和馬薩諸塞大學的研究人員的確發現了這種開關。這些anti-CRISPRs是來源于噬菌體的蛋白抑制劑，可幫助噬菌體逃避細菌的CRISPR/Cas免疫系統。它們最初是在I型CRISPR/Cas系統中發現的，但基因組編輯主要依賴II型CRISPR/Cas系統，因此對研究人員來說不是很有用。

　　2016年底，多倫多大學的April Pawluk等人在《Cell》雜志上報告稱，他們在腦膜炎奈瑟氏菌（Nme）中發現了II型系統的三種anti-CRISPRs。盡管化膿性鏈球菌的Cas9（SpyCas9）是最常用的CRISPR系統，但腦膜炎奈瑟氏菌也可用于基因組編輯。

　　anti-CRISPRs抑制Cas9的活性

　　當這三種anti-CRISPRs在腦膜炎奈瑟氏菌中表達時，它們抑制了NmeCas9的活性。在HEK293細胞中表達時，它們也能抑制NmeCas9。對于這些實驗，研究人員用三種質粒轉染細胞，這些質粒分別表達：1) NmeCas9，2) sgRNA和3) anti-CRISPR(Acr)。通過T7核酸內切酶1（T7E1）分析，研究人員發現，Acr的表達使編輯從30%降低到0-10%。

　　anti-CRISPRs阻止dCas9結合

　　除了作為基因組編輯的“關閉開關”，一種anti-CRISPRs（AcrIIC3Nme）也阻止了NmeCas9與DNA的結合。為了驗證這一點，研究人員在U2OS細胞中表達GFP標記的dNmeCas9與mCherry標記的dSpyCas9。當anti-CRISPR不存在時，dNmeCas9（綠色）和dSpyCas9（紅色）共同出現，表現為黃色。之后，anti-CRISPR的表達便消除了綠色位點，說明它對dNmeCas9結合DNA的強力抑制。

　　anti-CRISPRs的出現讓Cas9基因組編輯工具箱又多了一種工具。研究人員已經證明了它們能夠抑制細菌和哺乳動物細胞中的Cas9基因組編輯，并且能夠抑制dCas9與DNA的結合。現在，這些質粒已經在Addgene網站上提供。也許，它們也能為您助上一臂之力。