多元實時PCR實驗

PCR Super Mix-UDGROX 染料蒸餾水反向引物正向引物

ABIPrism7700型號系列檢測系統

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

以50ul反應體系為例。

Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG(Invitrogen11730-025)         25ul

ROX染料（Invitrogen12223012)                                                        1ul

滅菌的蒸餾水（Gibco15230-162)                                                      10ul

10umol/L反向引物I                                                                              1ul

10umol/L正向引物I                                                                              1ul

10umol/L反向引物II                                                                             1ul

10umol/L正向引物II                                                                             1ul

小計                                                                                                    40ul

溶于0.1XTE或無菌水的模板                                                                10ul

總計                                                                                                     50ul

2. 專門的儀器

ABIPrism7700型號系列檢測系統。

二、方法

1.PCR循環時的溫度條件與方案2相同

典型的多元擴增結果見圖15-3(見封二彩圖)。實驗以白介素-4 為目的基因，以肌動蛋白基因（看家基因）為參照基因。結果表明，當β-肌動蛋白基因為 10⁶ 拷貝數時，對白介素-4 的定量范困為 22~3X15 拷貝。對 PCR 條件沒有進一步優化，體系中試劑的濃度與一元擴增時的完全相同。以防實時 PCR 效率下降，可以按照下面步驟對 PCR 體系進行優化。

2. 優化多元反應的條件

a. 對于高風度基因（特別是看家基因）其引物濃度可以降低到其他基因引物濃度 1/4。

b.MgCl₂ 濃度從 3 mmol/L 升到 6 mmol/L。

c. 每種 dNTP 濃度提高到 400umol/L。

d. 聚合酶的酶量加倍（反應體系中每 1ul 為 0.06U)。也可以使用 PlatinumTaqDNA 優質聚合酶（Invitrogen10966-018)。