同時測定三聚氰胺和三聚氰酸（一）

本文通過LC-MS和戴安公司的混合基質柱WAX-1，對寵物食品和生物樣品中的三聚氰胺和三聚氰酸進行了有效的檢測，取得了理想的實驗結果。

由于寵物食品被三聚氰胺和三聚氰酸污染，當三聚氰胺和三聚氰酸同時存在時會形成一種不溶結晶物，這種物質可能影響到腎臟功能，最近的研究發現很多寵物的死亡和健康問題是由此引起的，受污染的麥子、稻米和玉米可能被制成人類食物如面包、意面、嬰兒食品等，所以對原材料包括可疑性動物組織中三聚氰胺和三聚氰酸的檢測就十分重要。

現在對三聚氰胺和三聚氰酸的定量方法包括氣質（GC-MS）和液質（LC-MS）。GC-MS的缺點是需要費時費力衍生化，而報道的LC-MS方法需要很長時間的梯度運行及柱子清洗。

本文介紹了一種靈敏、簡單和高通量的LC-MS方法，使用穩定的同位素標記的內標物（ISTD）來定量，可同時測定三聚氰胺和三聚氰酸。

使用戴安公司最新開發的混合基質柱WAX-1來分離被分析物，此柱子利用疏水和離子交換混合作用機理來達到特殊的選擇性和保留。色譜運行時間僅用8min，MSQ質譜檢測器確保選擇性和靈敏度。對于兩種物質（2~200 ng/ml）的線性都能達到R2>0.9995。方法檢出限（MDL）方面，三聚氰胺為3.97 ng/ml，三聚氰酸為3.32 ng/ml。

本文通過寵物食品提取物以及生物基質（豬肉和魚肉組織的提取物）來驗證方法的可靠性，寵物食品用快速、簡單和自動的提取方法處理。生物樣品來自美國FDA，并按規定方法處理。

實驗條件

儀器及軟件

戴安Summit HPLC系統：P680 泵；ASI-100 自動進樣器；TCC-100 柱溫箱；UVD-340 UV-Vis 檢測器；戴安MSQ Plus單四極質譜檢測器（ESI源）；Chromeleon 6.8色譜管理軟件。

分析柱：戴安公司Acclaim 混合基質柱WAX-1（150×2.1mm, 5um）；流速：等度90%乙腈/10% 20mM pH4 醋酸銨緩沖液（v/v），0.25 ml/min；柱溫：20℃；進樣量：5ul。

MSQ質譜條件

分析模式：SIM帶極性切換；錐孔電壓：50 V；間隔時間：0.5 S，對于所有SIM通道；探針溫度：500℃；掃描：4 SIM全程掃描，兩個不同極性的全掃描（100~400 m/z,250 ms），見表1。三聚氰胺和三聚氰酸的結構以及全波段掃描的質譜圖見圖1。

圖1.  全波段掃描三聚氰胺和三聚氰酸的質譜圖。

1.  全程掃描

色譜條件

色譜方法開發

色譜優化

流動相組成：在HILIC模式下，高有機物濃度的流動相容易使極性物質保留更長，并在ESI條件的MS上有更大的響應。然而，在WAX-1柱上的分離由于有弱陽離子的交換，對流動相中離子強度和pH的改變很敏感。為了保持方法的重現性，需要合適的緩沖容量，所以選擇10% pH4的醋酸銨。

緩沖液pH

當三聚氰胺和三聚氰酸同時存在于不同pH條件的不同基質（有機、離子或混合物）中，越是在疏水的環境下保留時間越長，這可以用離子交換機理來解釋。pH對保留時間的影響效果見圖2。

圖2.  流動相pH值對保留時間的影響。

離子強度

戴安的WAX-1混合基質柱由于弱陽離子交換模式能為極性物質提供特殊的選擇性，極性越大的化合物對流動相離子強度的依賴越大。如圖3所示，通過將流動相的總離子強度從2.75mM增加到11.0mM，三聚氰酸的保留時間可以從12.42min減少到7.40min。