葉綠素的最早提取和分離的是哪一年

葉綠素，是高等植物和其它所有能進行光合作用的生物體含有的一類綠色色素。葉綠素a 和葉綠素b 均可溶于乙醇、乙醚和丙酮等溶劑，不溶于水，因此，可以用極性溶劑如丙酮、甲醇、乙醇、乙酸乙酯等提取葉綠素。

提取步驟：
葉綠素提取的準備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：
(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。
(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗后的葉子碎片為無色。
(3)將過濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質被丟棄，只剩石油醚溶液。
(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。
(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行干燥，并將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。
(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。
(7)將位于藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進行過濾后，得到葉綠素a。
(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。

分離
色譜法是一種很好的分離純化、鑒定有機化合物的重要方法，尤其是在微量分析中應用的更是廣泛。果蔬中色素主要包括脂溶性的胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素和水溶性的花青素。在提取實驗時，我們可以利用相似相溶的原理把水溶性的花青素濾掉，繼而可以利用薄層色譜、柱色譜、高效液相色譜對胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素進行分離，由于這三種色素的極性依次減弱，可以適當地選擇單一的有機溶劑或者不同配比的混合溶劑作為展開劑和洗脫劑，確定最佳的優化分離條件。

具體的實驗步驟如下：

一 實驗目的
1．掌握提取葉綠素的方法；
2．了解薄層層析的原理，掌握薄層層析的一般操作和定性鑒定方法

二 實驗原理
1．葉綠素提取
高等植物體內的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a (C55H72O5N4Mg)、葉綠素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡蘿卜素(C40H56)和葉黃素(C40H56O2)等4種。葉綠素a和葉綠素b為吡咯衍生物與金屬鎂的配合物，胡蘿卜素是一種橙色天然色素，屬于四萜類，為一長鏈共軛多烯，有α、β、γ三種異構體，其中，β異構體含量最多。葉黃素為一種黃色色素，與葉綠素同存在于植物體中，是胡蘿卜素的羥基衍生物，較易溶于乙醇，在乙醚中溶解度較小。根據它們的化學特性，可將它們從植物葉片中提取出來，并通過萃取、沉淀和色譜方法將它們分離開來。

2．薄層色譜
薄層層析是快速分離和定性分析微量物質的一種極為重要的實驗技術，具有設備簡單、操作方便而快速的特點。它是將固定相支持物均勻地鋪在玻片上制成薄層板，將樣品溶液點加在起點處，置于層析容器中用合適的溶劑展開而達到分離的目的。用此法分離時幾乎不受溫度的影響，可采用腐蝕性顯色劑，而且可在高溫下顯色，特別適用于揮發性小或在較高溫度下易發生反應的物質，同時也常用來跟蹤有機反應或監測有機反應完成的程度。
薄層層析的器材選擇：

（1）基板：玻璃、塑料、金屬箔，常用玻璃板。

（2）吸附劑：
吸附劑要有合適的吸附力，并且必須與展開劑和被吸附物質均不起化學反應。可用作吸附劑的物質很多，常用的有硅膠和氧化鋁，由于吸附性好，適用于各類化合物的分離，應用最廣。選擇吸附劑時主要根據樣品的溶解度、酸堿性及極性。氧化鋁一般是微堿性吸附劑，適用于堿性物質及中性物質的分離；而硅膠是微酸性吸附劑，適用于酸性物質及中性物質的分離。以下簡單介紹吸附劑的幾個基本參數。
種類：常用：氧化鋁（強極性）、硅膠（中強極性）
不常用：硅藻土、纖維素、糖類、活性碳
符號：H——無任何添加劑；G——加有鍛石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合劑；
F——加有熒光素（Fluorescein）
CMC——加有羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose）
例：硅膠GF254表示硅膠中既加有煅石膏粘合劑，也加有熒光素，可以在波長254nm的紫外光下激發出熒光
粒度：目：1cm2內的篩孔數，數目越大，顆粒越小。薄層所用吸附劑顆粒較細，氧化鋁為200目，硅膠為100~150目。
μ：顆粒的平均直徑，以微米表示。例如：40μ的顆粒與100目相當。
活性：
吸附劑按其含水量的多少各分為五個等級：I級含水量最少，活性最高；V級含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分離效果越好，選用哪種活性級別的吸附劑，要用實驗的方法來確定。
酸堿性：
市售氧化鋁有酸性（用以分離酸性化合物）、中性、堿性（用以分離生物堿等堿性化合物），其蒸餾水洗出液的pH值分別為4、7.5、9—10；其中以中性氧化鋁應用最廣，可用來分離各種化合物，特別是那些對酸、堿敏感的化合物。
硅膠沒有酸堿性之分。

（3）展開劑
在樣品組分-吸附劑-展開劑三個因素中。對一確定組分，樣品的結構和性質可看作是一不變因素，吸附劑和展開劑是可變因素。而吸附劑的種類有限，因此選擇合適的展開劑就成為解決問題的關鍵。展開劑的選擇有以下要求:
（a）對待測組分有很好的溶解度。
（b）能使待測組分與雜質分開，與基線分離。
（c）使展開后的組分斑點圓而集中，不應有拖尾現象。
（d）使待測組分的Rf值最好在0.4~0.5，如樣品中待測組分較多，Rf值則可在0.25~0.75范圈內，組分間的Rf值最好相差0.1左右。由于薄層色譜法用途非常廣泛，國內外均有現成的鋪有吸附劑的薄層板出售。一般實驗室中也可自己制備。
(e)不與組分發生化學反應，或在某些吸附劑存在下發生聚合。
(f)具有適中的沸點和較低的粘滯度。
展開劑的極性是指與樣品組分相互作用時。展開劑分子與吸附劑分子的色散作用、偶極作用、氫鍵作用及介電作用的總和。展開劑要根據樣品的極性及溶解度，吸附劑活性等因素進行選擇，總的原則是展開劑的極性能使組分的Rf值在0.5左右。常用溶劑極性次序是：石油醚<環己烷<苯<乙醚<氯仿<乙酸丁酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇。
如一種溶劑不能充分展開，可選用二元或多元溶劑系統。

3．展開槽與展開：
薄層的展開在密閉的容器即展開槽或稱為層析缸中進行。
展開：
合適的展開劑用量為浸及下端硅膠，但不浸及樣點；點樣端向下，每次只展開一塊，放在正中，以免爬斜（進而展開傾斜）。

4．顯色：
如果化合物本身有顏色，就可直接觀察它的斑點。如果本身無色，可先在紫外燈光下觀察有無熒光斑點（有苯環的物質都有），用鉛筆在薄層板上劃出斑點的位置；對于在紫外燈光下不顯色的，可放在含少量碘蒸氣的容器中顯色來檢查色點（因為許多化合物都能和碘成黃棕色斑點），顯色后，立即用鉛筆標出斑點的位置。常用
普適性顯色劑：濃硫酸、碘蒸氣、熒光素，專用顯色劑：茚三酮、三氯化鐵溶液等。

三、實驗儀器與藥品
儀器：半微量玻璃儀器一箱，小燒杯，層析缸(槽)，載玻片(100mm×25mm)干燥器，電吹風，毛細管，移液管，研缽，布氏漏斗，抽濾裝置。
試劑：硅膠，1％ CMC，石油醚（60~90℃），乙醇，丙酮，乙醚，飽和NaCl溶液，無水Na2SO4

四、實驗步驟

1．制板：
將硅膠加 1％ CMC，調成槳狀(硅膠：CMC=1:3~4)（在平鋪玻璃板上能晃動但不能流動），將其涂在載玻片上（100mm×25mm）），為使其坦平，可將載玻片用手端平晃動，至平坦為止，放在干凈平坦的臺面上，晾干之后放入105℃烘箱活化1小時，取出放入干燥器內待用。

2、葉綠素的提取
在研缽中放入幾片(約5g)菠菜葉(新鮮的或冷凍的都可以．如果是冷凍的，解凍后包在紙中輕壓吸左水分)。加人10mL2:1石油醚和乙醇混合液，適當研磨。將提取液用滴管轉移至分液漏斗中，加人10 mL飽和NaCl溶液(防止生成乳濁液)除去水溶性物質，分去H2O層，再用蒸餾水洗滌兩次。將有機層轉入干燥的小錐形瓶中，加2g入無水Na2SO4干燥。干燥后的液體傾至另—錐形瓶中(如溶液顏色太淺，可在通風柜中適當蒸發濃縮)。

3、點樣
用一根內徑 1mm的毛細管，吸取適量提取液，輕輕地點在距薄板一端1.5cm處，平行點兩點，兩點相距1cm左右。若一次點樣不夠，可待樣品溶劑揮發后．再在原處點第二次，但點樣斑點直徑不得越過2mm。

4、展開
先在層析缸中放入展開劑[石油醚（60~90℃）-丙酮—乙醚(體積比為3:1:1)]，加蓋使缸內蒸氣飽10min， 再將薄層板斜靠于層析缸內壁。點樣端接觸展開劑但樣點不能浸沒于展開劑中，密閉層祈缸。待展開劑上升到距薄層板另一端約1crm時，取出平放，用鉛筆或小針劃前沿線位置，晾干或用電吹風吹干薄層。

五、實驗注意事項
1．制板時用注意使板上硅膠厚度盡量一致。
2．植物葉片不要研成糊狀，否則會給分離造成困難