β葡萄糖苷酶的研究

1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中發現了β-葡萄糖苷酶。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，屬于水解酶類，又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解結合于末端非還原性的β-D-糖苷鍵，同時釋放出配基與葡萄糖體。
β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中，它可以來源于植物、微生物，也可來源于動物。β-葡萄糖苷酶的植物來源有人參、大豆等；微生物來源的報道較多，如原核微生物來源的有腦膜膿毒性黃桿菌(Flavobacterium meningosepticum)、約氏黃桿菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物來源的有清酒酵母(Candida peltata)、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的動物來源有蜜蜂、 豬肝和豬小腸等。鑒于β-葡萄糖苷酶的研究廣泛，本文對其一些研究進展進行討論。

1 β-葡萄糖苷酶的分類
β-葡萄糖苷酶按其底物特異性可以分為3類：第一類是能水解烴基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此類β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纖維二糖、對硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二類是只能水解烴基-β-葡萄糖苷的酶，這類β-葡萄糖苷酶能水解纖維二糖等；第三類是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，這類酶能水解對硝基苯-β-D-葡萄糖苷等類似物。

2 β-葡萄糖苷酶的提取、純化及酶活測定方法
2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法
不同來源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。動植物體及大型真菌中的糖苷酶一般需要對酶源進行組織搗碎，然后用緩沖液浸提。常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液等。pH值一般選用酶的穩定pH值；提取溫度適于低溫，一般為4 ℃。利用微生物發酵法生產β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一來源，一般微生物發酵都采用液態發酵。對于胞外酶來講，發酵液即為粗酶液；對于胞內酶，則需對微生物進行細胞破碎，使其釋放出β-葡萄糖苷酶。
2.2 β-葡萄糖苷酶的純化方法
粗提的β-葡萄糖苷酶可采用硫酸銨沉淀或用乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀等方法初步分離。β-葡萄糖苷酶的進一步純化，往往是根據具體情況，采用多種方法逐步分離。目前分離β-葡萄糖苷酶的方法較多，其中離子交換柱層析和凝膠過濾柱層析兩種手段結合使用最為普遍，多數是先離子交換柱層析，后用凝膠過濾柱層析。離子交換柱層析方法中常用的是陰離子交換層析，如DEAE陰離子交換層析；同時，陽離子交換層析法也有一定的使用。除上述兩種分離方法外，也有其它層析方法用于分離β-葡萄糖苷酶，如使用疏水層析法和羥基磷灰石層析法等。此外，也有人采用雙水相萃取和親和層析的方法來分離β-葡萄糖苷酶，但關于這方面的研究報道較少。
2.3 β-葡萄糖苷酶活性測定方法
β-葡萄糖苷酶的活性測定方法很多，常見反應底物有對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纖維二糖、水楊苷等。由于酶與pNPG作用產生的對硝基苯可用分光光度法在400 nm處測定， 方法簡單、反應快速、反應活性大，所以大多數實驗采用pNPG作為底物的分光光度法測定酶活性。由于測定葡萄糖含量的方法很多，也有人通過測定葡萄糖含量來確定酶活力。孫迎慶等用多種方法測β-葡萄糖苷酶活性，如以二糖或寡糖為底物，用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶測定產生的葡萄糖量的方法來確定β-葡萄糖苷酶活性；用水楊苷為底物，將水楊苷裂解為水楊醇和葡萄糖，然后將酶解產物中的水楊醇用4-氨基安替吡啉作顯色劑顯色，用分光光度法在515 nm下比色測定β-葡萄糖苷酶活性。
3 β-葡萄糖苷酶的酶學性質
不同來源的β-葡萄糖苷酶在氨基酸序列、分子量、比活力、等電點、最適反應pH值、pH值穩定性范圍、最適反應溫度和熱穩定性范圍上均有很大差別（見表1）。

3.1 β-葡萄糖苷酶的分子量大小
β-葡萄糖苷酶由于其來源不同，它們的相對分子量也可能不同，而且它們的結構和組成也有很大差異。β-葡萄糖苷酶的相對分子量范圍一般在40～250 kDa之間，而其結構可能是由單亞基、雙亞基或多亞基構成。此外，有的菌株本身含有胞內和胞外β-葡萄糖苷酶，因此，有時來源于同一菌株的β-葡萄糖苷酶是兩種不同分子量酶的混和物，甚至是多種不同分子量酶的混合物。
3.2 β-葡萄糖苷酶最適pH值及pI值
目前很多的研究結果表明，β-葡萄糖苷酶為酸性蛋白酶，其最適反應pH值一般在3.0～7.0范圍內，其中許多酵母、細菌的胞內β-葡萄糖苷酶的最適反應pH值接近6.0左右；一般β-葡萄糖苷酶的pH值穩定性范圍較廣，在pH值3.0～10.0范圍內，糖苷酶的穩定性較好。對大部分β-葡萄糖苷酶而言，它們的pI值都在酸性范圍，并且變化不大，一般在3.5～5.5之間。如來源蜜蜂的β-葡萄糖苷酶，其pI值接近4.5～4.8。
3.3 β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度和熱穩定性
β-葡萄糖苷酶的最適反應溫度為40～110 ℃。一般來說，來自古細菌的β-葡萄糖苷酶其熱穩定性和最適反應溫度要高于普通微生物或動物來源的β-葡萄糖苷酶。
3.4 β-葡萄糖苷酶底物特異性
大多數的β-葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結構的專一性較差，能裂解C-O糖苷鍵、C-S鍵、C-N鍵、C-F鍵等；β-葡萄糖苷酶對底物糖基部分的C4和C2構形也不專一，能同時水解β-葡萄糖苷鍵和β-半乳糖苷鍵，有些甚至C6位的專一性也不高，能水解木糖。在很多底物中，β-葡萄糖苷酶對纖維二糖和人工合成的底物對硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG) 表現出較高的酶活性。此外，也有一些β-葡萄糖苷酶對底物表現出很強的專一性。Franck E. Dayan等(2003)從Podophyllum peltatum的葉子中提取的β-葡萄糖苷酶對足葉草毒素-β-D-葡萄糖苷（podophyllotoxin-4-O-β-D-glucopyranoside）有很高的專一性，對烴基-β-葡萄糖苷（如寡糖、纖維二糖、纖維三糖等）的水解作用較小，對芳香基-β-葡萄糖苷根本沒有水解作用。
3.5 金屬離子及化合物對β-葡萄糖苷酶的影響
許多β-葡萄糖苷酶的酶學性質研究都表明，葡萄糖是β-葡萄糖苷酶的典型抑制劑。Hg2+、Cu2+和Ag+對大部分酶抑制作用較明顯，SDS(十二烷基磺酸鈉)及脲對酶也有不同程度的抑制作用。但Mn2+ 和Co2+對該酶有明顯的激活作用。

4 β-葡萄糖苷酶的結構及催化機理
4.1 β-葡萄糖苷酶的結構
按糖苷酶的氨基酸序列分，大多數β-葡萄糖苷酶屬于糖苷酶族1，糖苷酶族1有明顯的桶狀結構。但是，也有一些β-葡萄糖苷酶屬于糖苷酶族4，屬于糖苷酶族4的β-葡萄糖苷酶往往要求在催化過程中有脫氫酶和輔助因子參與，有文獻報道，6-磷酸-β-D-葡萄糖苷酶在催化過程中需要Mn2+和輔酶NAD+的參與。
4.2 β-葡萄糖苷酶的活性中心結構
有研究表明，β-葡萄糖苷酶中起催化作用的殘基是兩個谷氨酸殘基。采用定點突變的方法證明，靠近N-端的谷氨酸是酸堿基團，另外一個是親核基團。
4.3 β-葡萄糖苷酶的催化機理
對分別來自Agrobacterium和Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶進行研究發現，兩種來源的β-葡萄糖苷酶在催化反應時是按同一種反應機制進行的，即在催化水解糖苷鍵反應時都遵循雙取代反應機制（Double Displacement Mechanism）。其反應方程式如下：

在催化反應中，需要兩個重要的氨基酸殘基作為質子供體（Proton donor）和親核基團（Nucleophile）。水解反應的基本過程可以分為3步：第一步是酶與底物鍵合形成米氏復合物ES；第二步是酶的親核基團在酸堿催化（提供一個質子）幫助下，去攻擊底物的糖苷鍵O原子，形成共價的糖基酶中間體E-S，在這個過程中，β-葡萄糖苷酶的活性中心可以根據不同類型的底物而相應發生一定程度的結構變化，使β-葡萄糖苷酶可以和多種糖類底物結合，這一步決定了β-葡萄糖苷酶具有的底物專一性；第三步是酶底物過渡態的水解，酸或堿基團催化一個水分子攻擊中間體E-S，與之反應，以切斷糖苷鍵，釋放β-糖基產物，并使酶恢復其初始的質子化態。
以上三步反應基本上可以解釋β-葡萄糖苷酶的催化機理。但是不同族的β-葡萄糖苷酶在反應機理上又稍微有所不同，如糖苷酶族4，該族糖苷酶的催化反應過程需要二價金屬離子和NAD+的參與，脫氫酶NAD(H)和底物通過與Mn2+的共價結合，三者形成“V”字形。底物在脫氫酶的作用下變成酮式結構，接著在酸催化和堿催化的作用下，酶與底物形成中間過渡態。最后由水分子攻擊糖基酶中間體中糖基上的雙鍵，同時底物酮式結構消失，β-糖基產物得到釋放，此外NAD+得到再生。

5 應用及展望
目前對β-葡萄糖苷酶的理化性質研究得比較透徹，但是對它的應用開發研究力度還是不夠。在飼料工業上，β-葡萄糖苷酶通過破解富含纖維的細胞壁，使其包含的蛋白質、淀粉等營養物質釋放出來并加以利用，同時又可將纖維降解為可被畜禽機體消化吸收的還原糖，從而提高飼料利用率。此外，在食品開發上，其作為特殊的風味酶已得到應用，如李平等將黑曲霉β-葡萄糖苷酶應用在果汁、茶汁、果酒等制備上，能起到較好的增香效果。
今后對β-葡萄糖苷酶的主要研究應放在其應用開發方面，而不是去尋找新的、更廣泛的來源，加大其在食品保健品、飼料、醫藥行業的開發，以實現其酶制劑的價值。