主要加工方式是切斷和堿基修飾。真核生物tRNA前體一般無生物學特性，需要進行加工修飾。加工過程包括：
（1）剪切和拼接
tRNA前體在tRNA剪切酶作用下，切成一定大小的分子。大腸桿菌RnaseP特異切割tRNA前體5′旁側序列，3′－核酸內切酶如RnaseF可將tRNA前體3′端一段序列切下來。RnaseD可水解3′端多余核甘酸。剪切后的tRNA分子在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需片斷拼接起來。
（2）稀有堿基的生成
1）甲基化：例如在tRNA甲基轉移酶的催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤。
2）還原反應：某些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶（DHU）。
3）核苷內的轉位反應：如尿嘧啶核苷轉位為假尿嘧啶核苷。
4）脫氨反應：某些腺苷酸脫氨成為次黃嘌呤（Ⅰ），次黃嘌呤是頗常見于tRNA中的稀有堿基之一。
（3）加上CCA-OH3′-末端：在核苷酸轉移酶的作用下，在3′-末端刪去個別堿基后，換上tRNA統一的CCA-3′-末端，完成柄環結構。