實驗概要
monESCs傳代、凍存及復蘇
主要試劑
DMEM/F12培養液、monESCs培養液、凍存液C、1 mg/mL膠原酶Ⅳ
主要設備
15 mL離心管，5 mL、10 mL移液管，凍存管、6孔培養板、倒置顯微鏡
實驗步驟
傳代前一天首先準備好MEF飼養層細胞，飼養層細胞要求密度為1.2×104～1.5×104 cells/cm2，切忌密度過高
①傳代之前首先在37℃水浴鍋中預熱Ⅳ型膠原酶、DMEM/F12培養液和monESCs培養液。
②傳代時首先吸棄舊的培養液上清，然后用DMEM/F12培養液輕輕沖洗一遍，之后加入1mg/mL的Ⅳ型膠原酶，放在培養箱中消化10min左右，消化過程中在顯微鏡下注意觀察消化的效果，當克隆邊緣卷起時可以終止消化，直接棄掉酶，加入新鮮的DMEM/F12培養液洗一遍。
！注意：monESCs的消化時間和其狀態以及膠原酶Ⅳ的儲存時間相關，新鮮配制的酶一般作用較快。
③再次加入DMEM/F12培養液1 mL/孔，用2 mL移液管頭輕劃仍然在皿底附著的ES克隆，并用移液管輕柔吹吸幾次，此時將獲得含有小克隆團塊的monESCs懸液。
④將細胞懸液轉移到15 mL的離心管中，室溫800 r/min離心2 min。
⑤離心結束后，棄掉上清，用適量的monESCs培養液重懸離心后的細胞，將其接種到新的飼養層細胞上。
!注意：一般傳代比例為1:4～1:6，視細胞密度而定。如分化細胞多，應先取出分化細胞，再進行傳代。
（2）monESCs凍存
①凍存細胞時，最好提前2 h更換新鮮培養液。
②準備凍存液C并放到冰上預冷。
③按monESCs傳代的方法，用Ⅳ型膠原酶消化、離心收集細胞團塊懸液。
④吸棄上清，加入合適體積的凍存液C，細胞的濃度最好能在2×106～5×106 cells/mL，輕輕地吹打細胞，之后分裝到凍存管，一般來說每個凍存管內的細胞可以復蘇到6孔培養板的一個孔中。
⑤用程序凍存盒或分步法凍存細胞，記錄細胞名稱、凍存時間、凍存代次、復蘇劑量、凍存者姓名等信息。
！注意：-80℃凍存不要超過3日，3日內需轉入液氮中長期保存。
（3）monESCs復蘇
①復蘇前一天首先準備好MEF飼養層細胞，飼養層細胞要求密度為1.2×104～1.5×104 cells/cm2，切忌密度過高。
② 37℃水浴鍋中預熱monESCs培養液。
③從液氮中取出細胞，放到37℃水浴中迅速融化，可以用鑷子夾住來回攪動至融化。
④把凍存的細胞懸液約0.5 mL轉移至15 mL離心管中，之后逐滴加入預熱過的monESCs培養液約4.5 mL(凍存細胞體積∶復蘇時培養液體積=1∶9)，室溫1000 r/min離心3 min。
⑤用monESCs培養液重懸細胞后接種到事先準備好的飼養層細胞上。
⑥每日更換新鮮monESCs培養液。
！注意：monESCs在凍存后存活率較低，僅有20%～30%，可能的原因是monESCs培養的技術體系不如小鼠和hESCs培養的技術體系成熟。monESCs復蘇后前幾日克隆可能觀察不明顯，如培養至7日以上仍未見克隆形成可放棄此次復蘇，如發現克隆形成，一般需培養至10～14日進行傳代。