一、概述
1、介紹
microRNA(miRNA)是一類有大約22 個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中。miRNA 在個體發育的不同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發育和分化中起有重大的調控作用。迄今為此，對miRNA 的檢測方法主要有Northern Blot 等基于分子雜交的方法，這些方法敏感度低、耗時長、RNA 的用量較大。miRNA Q-PCR etection Kit采用了國際上公認的核酸檢測標準技術――Real-Time PCR 技術來對miRNA 進行檢測，其具有快速、特異性強、靈敏度高等優點。
2、實驗原理
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set包含了miRNA特異的逆轉錄引物，以及qPCR正、反向引物套裝。其中莖凸環結構狀的miRNA特異逆轉錄引物可特異性的轉錄成熟的miRNA。再利用高度特異的正反向引物，使miRNA定量即靈敏又高度特異。
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set提供了一種最低能檢測到5個拷貝目標miRNA的高靈敏度的檢測方法，并且具有一個7 個數量級的動態變化范圍，反應的模板可以是總RNA或者已純化的小RNA等。
3、產品內容
名稱
介紹
量
RT Primer
miRNA Reverse Transcription Primer
2 nmol
Forward Primer
miRNA Forward Primer
2 nmol
Revers Primer
Universal Reverse Primer
2 nmol
二、實驗準備
1、客戶需自己提供實驗試劑
一步法或兩步法qPCR mix，反轉錄酶，RNA 酶抑制劑，DEPC-H2O 等
2、耗材準備
無RNase，DNase 的吸頭，離心管等
3、引物準備
引物為干粉形式，需先離心，后每管加入200 μL DEPC-H2O稀
釋至10μM，混勻后于-20oC凍存備用
4、儀器準備
離心機、實時熒光定量PCR 儀等
三、實驗步驟
1．兩步法擴增
先將miRNA做反轉錄miRNA cDNA，然后再進行qPCR定量
1.1 RT Primer Mix的配置
EzOmicsTM miRNA qPCR Detection Primer Set可以同時檢測50個以內的miRNA分子。反轉錄之前，需預先配置RT Primer Mix(200nM)。如果需要用5S rRNA 或U6 snRNA 做內參對照，需同時配置Random Primer或內參的Reverse Prime做反轉錄引物。
1.2 逆轉錄體系
試劑
體積
終濃度
RNA模板
0.2ng~1μg
根據實驗需求
RT Primer Mix
5 μl
20nM
10×RT Buffer
5 μl
1×
RNase inhibitor
見試劑供應商說明書
dNTP (2.5mM)
4 μl
200nM
逆轉錄酶
見試劑供應商說明書
DEPC-H2O
補足至50μl
1.3 逆轉錄程序
反應完成后，將miRNA cDNA存放于-20℃（長期保存請分裝保
存于-80℃）。
1.4 miRNA實時定量 PCR反應體系
1.5 實時定量 PCR反應程序
2．一步法擴增：
將miRNA反轉錄和qPCR定量兩個過程放在一個管子中進行
2.1 一步法miRNA定量體系的建立
2.2 實時定量 PCR反應程序
來源：百奧邁科生物技術有限公司
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