從真核生物的組織或細胞中提取mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成cDNA的第一鏈和第二鏈,將雙鏈cDNA和載體連接,然后轉化擴增, 即可獲得cDNA文庫,構建的cDNA文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調控的分析;比較cDNA和相應基因組DNA序列差異可確定內含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之cDNA的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自70年代中葉首例cDNA克隆問世以來,已發展了許多種提高cDNA合成效率的方法,并大大改進了載體系統，目前cDNA合成試劑已商品化。cDNA合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成cDNA第一鏈,聚合酶合成cDNA第二鏈,加入合成接頭以及將雙鏈DNA克隆到于適當載體(噬菌體或質粒)。 一、RNA制備 模板mRNA的質量直接影響到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的結構特點,容易受RNA酶的攻擊反應而降解,加上RNA酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶,人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液處理,再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學修飾劑,它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物,因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌,可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外,也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外,為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需經硅烷化處理。 細胞內總RNA制備方法很多,如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒,可快速有效地提取到高質量的總RNA。分離的總RNA可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特點,當RNA流經oligo (dT)纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素上,然后逐漸降低鹽濃度洗脫,在低鹽溶液或蒸餾水中,mRNA被洗下。經過兩次oligo(dT)纖維素柱,可得到較純的mRNA。純化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 二、cDNA第一鏈的合成 所有合成cDNA第一鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉錄酶)來催化反應。目前商品化反轉錄酶有從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶和從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶。AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴于RNA的DNA合成,依賴于DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴于RNA和依賴于DNA的DNA合成活性,但降解RNA
NA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。 AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶都必須有引物來起始DNA的合成。cDNA合成最常用的引物是與真核細胞mRNA分子3'端poly(A)結合的12-18核苷酸長的oligo(dT)。 三、cDNA第二鏈的合成 cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種: (1) 自身引導法 合成的單鏈cDNA 3'端能夠形成一短的發夾結構,這就為第二鏈的合成提供了現成的引物,當第一鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈,最后用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環,即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA 5'端序列出現缺失和重排,因而該方法目前很少使用。 (2) 置換合成法 該方法利用第一鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物,使之成為合成第二鏈的引物,在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優點: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一鏈反應產物,無須進一步處理和純化; (3) 不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發夾環。目前合成cDNA常采用該方法。 四、cDNA的分子克隆 已經制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣,可以插入到質粒或噬菌體中,為此,首先必需連接上接頭(Linker),接頭可以是限制性內切酶識別位點片段,也可以利用末端轉移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質粒,并轉化到宿主菌中進行擴增。合成的cDNA也可以經PCR擴增后再克隆入適當載體。 第二節 動植物組織mRNA提取 一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 二、設備 研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 2、75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 3、1×層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。 4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。 四、操作步驟 （一）動植物總RNA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。 1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。 5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 （二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。 1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。 4、將（一）中提取的RNA液于65℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。 5、測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 6、測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。 7、加入1/10體積的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20℃30分鐘。 8、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。 9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃）。 [注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。 2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 第三節 植物病毒RNA提取 大多植物病毒RNA為單鏈RNA，并且其極性與mRNA極性相同，植物病毒RNA提取較為簡單，一般使用酚氯仿即可獲得滿意結果。 一、材料 提純TMV病毒液（10mg/ml）。 二、設備 冷凍臺式離心機，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無RNA酶的雙菌水。 四、操作步驟 1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。 2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機相交界面無蛋白為止。 3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數十秒，4℃下12000g離心10分鐘。 4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。 5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。 6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無RNA酶的雙菌水或TE緩沖液中。 7、取10ml進行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。 [注意] 1、整個操作應盡可能在低溫下進行。 2、由于病毒RNA鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝去病毒外殼蛋白，一般需要多次進行酚/氯仿的抽提。
mRNA的分離與純化
真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。 寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA 一、試劑準備 1．3M醋酸鈉（pH 5.2） 2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。 4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC 二、操作步驟 1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。 2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。 3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。 5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。 6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。 7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。 8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。 三、注意事項 1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。 2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。 3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。 4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。 5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%