inscopix nVoke自由在體神經元成像系統在發現猝倒元兇的應用
發作性睡病（Narcolepsy）是一種由大腦神經系統障礙引起的疾病，其癥狀包括嗜睡、睡眠癱瘓、睡眠幻覺和猝倒。猝倒指在清醒狀態下，患者全身肌肉突然松弛無力，進入數秒乃至數分鐘的睡眠狀態，伴隨著極高的安全隱患，尤為可怕。
近日，來自南卡羅萊納醫科大學的研究人員利用由格羅貝爾為中國授權代理美國Inscopix公司的nVoke?在體鈣成像系統，首次發現了位于杏仁核中央區域（CeA）的GABAergic神經元在小鼠猝倒過程中的異常興奮現象，相關結果發表于eLIFE雜志。
圖1. 實驗動物免疫組化與熒光顯微圖像
研究人員敲除了小鼠的促食素基因（圖1B，促食素免疫染色），從而得到嗜睡癥模型動物。該促食素缺失小鼠與Slc32a1-ires-Cre+/+小鼠雜交，在后代基因組中插入GCaMP6s基因，得到了GABAergic神經元可以特異性表達鈣指示熒光蛋白的嗜睡癥模型小鼠（圖1 C-G，綠色為鈣熒光，圖F為GABAergic神經元指示物VGAT染色照片，與圖E鈣熒光重合度95%），作為實驗組。促食素未敲除的轉基因小鼠（圖1A）作為對照組。
圖2. 小鼠睡眠與清醒過程GABAergic神經元活動狀態
研究人員對實驗組和對照組各5只小鼠在睡眠和情緒階段進行了鈣成像和腦電肌電監測（圖2A，B），鈣成像在兩個組別中各識別出了186個和207個GABAergic神經元細胞。研究發現，不同的GABAergic細胞會在睡眠的不同階段被激活，使用Δf/f來表征細胞熒光強度的變化幅度，計算各階段細胞Δf/f的Z分數來剔除細胞數量干擾。圖2B展示了4種典型的細胞，分別為在快速動眼睡眠REMS階段激活、在非快速動眼睡眠NREMS階段激活、在活躍清醒AW階段激活和幾乎不激活。在各睡眠和清醒階段的細胞分布比例上，兩組別沒有顯示出顯著的區別。
圖3. 嗜睡組小鼠各神經細胞在不同階段Z分數變化曲線
在不受干擾的睡眠與清醒狀態結束后，小鼠被暴露于狼尿的氣味刺激下，兩組小鼠均表現出了典型的好奇與恐懼反應。對照組小鼠在該階段的Z分數有明顯提高，但統計學上不顯著（P=0.46，圖2C）。然而在嗜睡病小鼠中，經過3分鐘的氣味暴露，Z分數顯著升高（P<0.001，圖2C，圖3）；呈現激活狀態細胞的比例從31.88%提升到了60.22%，幾乎翻了一倍。研究人員將這種受刺激后Z值明顯高于未受干擾時平均Z值的AW定義為過度活躍清醒HAW，將由這種HAW引發的卒倒定義為情緒介導的卒倒EC。相反的，如果卒倒前只有普通的AW，這次卒倒則被定義為自發性卒倒SC。
在實驗中，研究人員共在實驗組小鼠中觀測到了10次SC和14次EC，而對照組一次卒倒都沒有發生，這說明促食素的存在可以明顯有效抑制GABAergic神經元過度興奮。在實驗組被記錄的186個神經元中，15個細胞被標識為SC激活，74個細胞為EC激活，兩者之間相互獨立沒有重疊，而在這74個EC激活細胞中，50%來自先前未得分的細胞，23%來自AW激活細胞。因此，在不受干擾下的睡眠/清醒活動中沉默的神經元，反而與猝倒有著密不可分的關系（圖3C，F）。
圖4. 狼尿刺激前后神經元活動趨勢圖