一、蛋白質的純化和肽段氨基酸序列分析
二、引物的設計
三、用 PCR 擴增目的 cDNA 片段
四、cDNA 的克隆及測序
五、cDNA 序列的分析及蛋白質一級結構的確定
| 實驗方法原理 |
將 SDS-PAGE 上的蛋白質樣品從凝膠上分離出來是很困難的，目前流行的方法是將蛋白質電印跡（electrobloting） 至 PVDF 膜上，直接進行序列分析或直接在膜上進行酶解，后者稱為原位分析。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 蛋白質樣品 |
| 試劑、試劑盒 | PVP-40 HAC 酶解緩沖液 蒸餾水 |
| 儀器、耗材 | Eppendoff 管 微量透析儀器或小凝膠過濾柱 |
| 實驗步驟 |
1. 蛋白質樣品的準備 進行序列分析的蛋白質樣品，一般純度要求大于 95％， 通常是用色譜和電泳精制過的。 1.1 SDS-PAGE 純化的樣品 從 SDS-PAGE 上分離的蛋白質必須經過特殊處理，使 SDS 濃度低于 0.0005％，否則 SDS 會影響到胰蛋白酶的酶解，也會明顯降低 HPLC 分離時的分辨力。在 SDS-PAGE 后，采用電印跡 （bloting） 轉移到 PVDF 膜上是常用的方法，因為 PVDF 膜結合蛋白質能力的專一性遠遠超過它與鹽、氨基酸和去垢劑的結合，因此能將蛋白質與這些雜質分開。經過這樣轉移的 PVDF 膜可直接用于化學裂解或酶解后的肽段氨基酸序列分析。 1.2 HPLC 純化的樣品 如果樣品是用反相 HPLC 純化的。 因為流動相是揮發性溶劑，在真空干燥或凍干樣品時可被除去。如果蛋白質是用離子交換 HPLC 或疏水 HPLC 或凝膠過濾 HPLC 精制的，則樣品要進行脫鹽。 1.3 蛋白質樣品中的一硫鍵和疏基 在蛋白質樣品純度達到要求，鹽和小分子也已除凈時，還要轉變半胱氨酸殘基或其他穩定的衍生物。因為半胱氨酸的巰基在分肽過程中易自動氧化成各種產物，包括形成無序的二硫鍵，因此需要將半胱氨酸殘基先轉變成穩定的衍生物。通常用碘代乙酸烷化，這個反應是快速和專一的；同時這類試劑保存在暗處是很穩定的。而且，這類試劑容易得到放射性標記物。蛋白質或肽在導入帶電荷基團后也增加了它們在水溶液中的溶解度。 2. 原位酶解和測序 2.1 將膜片剪成 1 mm 細條，放在 Eppendoff 管中； 2.2 加 1.2 ml 0.5％ PVP-40／0.1 mol／L HAC，37 ℃，保溫 30 min； 2.3 用蒸餾水洗膜 5 次以上，洗凈殘留的 PVP-40； 2.4 用酶解緩沖液漂洗，然后進行酶解； 2.5 酶解：蛋白酶在 100 mol／L NH4HCO3：ACN＝95：5，pH 8.2，37 ℃ 酶解過夜，對 V8 蛋白酶則在 100 mmol／L 磷酸鈉：ACN＝95：5，pH7.8，室溫過夜。酶：底物 1：10 至 1：20（W／W），對亞微克級樣品，酶：底物高達 2：1。酶解后 -20℃ 保存或立即用幾微升 10％ 三氟乙酸（TFA）酸化，上樣到 HPLC 柱上分析。如果蛋白質純品的量足夠多時，可采用常規的化學裂解或酶解方法得到可供進行氨基酸序列分析的肽段。
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| 注意事項 |
1. 磺代乙酸必須是無色的，有碘存在，呈淡黃色，會引起疏基迅速氧化，阻礙了烷化反應。 2. 微克級蛋白質的操作，實驗室內的溫度，灰塵，纖維，皮膚汗液和頭屑等都會影響結果。 3. 容器及透析袋表面的吸附作用致使蛋白質嚴重損失。建議用微量透析儀器或小凝膠過濾柱脫鹽。 |