一：儀器:同cDNA文庫構建技術-cDNA鏈的反轉合成
二：試劑:EcoRⅠ連接子試劑盒
三：操作:
1:cDNA加接頭反應
a:按下表準備反應體系
10×緩沖液T4DNA連接酶3μl
BSA 3μl
cDNA 2.5μl
連接子 1μl
T4DNA連接酶 1μl
加水至 30μl
b: 15℃保溫6-18小時
c:70℃加熱10分鐘后放置于冰浴
2:磷酸化反應
a:按下表準備反應體系
上述1.a反應物 30μl
T4磷酸激酶10×緩沖液 4μl
0.1mM ATP 2μl
T4激酶(10μ/μl) 1μl
水 3μl
總體積 40μl
b:37℃保溫30分鐘。用DNA純化柱純化帶接頭的cDNA
c: 用1ml Sephacryl S-400裝柱，TEN緩沖液平衡拄，平衡液流干后，加套管，800g5min
d: 上樣,用1mlTEN緩沖液洗柱2次,收集洗脫液。洗脫時加套管，800g5min
e：合并洗脫液.
D：3M NaAC和無水乙醇沉淀，干燥復溶
3:cDNA與載體聯接：
a:準備4個離心管,按下表加入
A B C D
載體DNA0.5ug/ul) 2
cDNA(10ng/ul) 0 32 1
10×T4DNA連接酶緩沖液 1
水 6 3 4 5
T4DNA連接酶 1
b:保溫，室溫:3小時;4℃過夜
4:體外包裝：
a：從－７０℃取出包裝蛋白，冰浴中溶化，每管50ul
b：包裝蛋白混合液完全溶化后，立即加入10ul“3.a”中的連接液，輕彈管壁，輕輕混勻。
c：22℃（室溫）放置3小時
d：上述包裝混合液中加入445ul的phage緩沖液和25ul氯仿，輕輕混勻，冰浴保存。（包裝液4℃下可存放7天）
5：感染
a：滅菌培養皿中倒入下層LB培養基，凝固后，37℃保溫
b；安1：1000的比例稀釋“4”中的包裝混合液。
c：取100ul稀釋液和100ul菌株（Y1090、LE392）
d：取4ml熔化45℃保溫的上層培養基加入到“c”中的混合液中，混勻后鋪板在37℃預熱的下層培養基上，37℃過夜。
6：收集和擴增文庫
構建的cDNA文庫經擴增后，才能保存和進行長期篩選。本文庫由λgt11作為載體而構成，因此擴增時應在大腸桿菌Y1090中進行。
a：在過夜后的培養皿上挑取出現的噬菌斑，加2－3mlSM緩沖液，室溫震蕩２小時。４℃7000g離心30min,以除去細胞碎片，分裝上清，溶解噬菌斑，4℃8000－10000g快速離心10min，以除去細胞碎片和培養基成分。
b：重復上步操作
c：上清液轉入一新管 中，如要在4℃短期保存則按１ml上清中加入20-30μl的比例加入氯仿，4℃保存；如要長期保存則應加入終濃度為７％的二甲基亞砜，于－70℃保存。以被需要時重新涂板篩選文庫。。
總結：C文庫構建的簡單流程為：
RNA－mRNA－cDNA單一鏈的合成－cDNA單二鏈的合成－加接頭－與載體連接－體外包裝－轉染－篩選文庫（見總RNA的提取(試劑盒法、氯化鋰法和蛋白酶－熱酚法)、mRNA的提取及純化（磁珠法和親和柱層析法）、cDNA文庫構建技術-cDNA鏈的反轉合成）