Western不同轉膜方法的取舍
轉膜:小分子量的蛋白半干轉效果比較好，大分子量（100KD）以上建議濕轉。具體轉膜條件需要多摸一下。30-80KD半干轉恒流1mA/cm2，1-1.5h 都可以，大分子濕轉100V，2.5h以上應該可以，轉完膜麗春紅染出的條帶比較清楚的話，一般都能有結果。濕轉，Buffer一定要預冷，最好提前一天配好放4度；濾紙不要大過PVDF膜，防止短路；膠在負極，膜靠近正極，放入Tank前檢查一遍會使你免以體會放反的痛心疾首；膜要標記好正反面；轉膜過程中，經常過去看看，防止意外，如電泳儀接觸不好。顯影:轉膜后看和你的蛋白分子量近似的預染Marker有沒有轉過去，如果marker沒問題，那基本可以認為你的蛋白轉過去了。顯色的話應該ECL好些吧，靈敏度更高呢，HRP標記的二抗孵育完后用TBST充分清洗，然后加ECL試劑，包好后壓片，一般如果你能夠看到熒光的話，壓片5min以內就可以看一下，如果看不見的話，直接壓半小時吧。暗室中壓片，壓片完后顯影......閱讀全文
Western免疫印跡
?Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。一、原理????與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝
Western－免疫印跡
實驗概要Western免疫印跡（Western ? Blotting）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。與Southern或Northern雜交方法類似，但Western ? Blot采用的是聚丙烯
western－blot試驗心得
前兩天做了一個western blot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！1 本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個
經典的western方法
Western轉膜步驟?下面的步驟適用于通過Xcell Ⅱ轉印系統進行蛋白印記的大部分應用。為達到最佳效果，用戶的優化是必要的。?I. 所需材料： • Xcell SureLock™或Xcell Ⅱ™ Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos
Western－blotting樣品準備
實驗概要Preparation of ?lysis buffers, protease and phosphatase inhibitors, lysate from cell ?culture, lysate from tissues, protein concentration, samples
Stripping－for－reprobing－western－blots
實驗概要Stripping ?is the term used to describe the removal of primary and secondary ?antibodies from a western blot membrane. Stripping is useful when on
Western－Blot－with－Platelet－Protein
OUTLINEWestern blot is a wide used technique to identify a target protein/s for the certain antibody.PROTOCOLPrepare platelets.Lyse washed platelets (
Western轉膜步驟
下面的步驟適用于通過Xcell Ⅱ轉印系統進行蛋白印記的大部分應用。為達到最佳效果，用戶的優化是必要的。I. 所需材料：?Xcell SureLock?或Xcell Ⅱ? Mini-Cell以及Blot Module（Cat. Nos. EI10001, EI9001及EI9051）?電泳后的迷你膠
Western樣品制備方法
一、細胞抗原和組織抗原樣品的制備1、細胞抗原的處理方法向收集到的細胞中加入RIPA裂解緩沖液（蛋白酶抑制劑在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解30-60min，然后再插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產生泡沫為宜，超聲每次2-3s，重復3或4次，12000g離心3-5min，吸取上清備用。2、
Western－Blot詳解（四）
還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結合pH范圍在4-7。結合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測序。5.Marker的相關疑問MM.我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，
Western－Blot詳解（七）
TTT.目的蛋白是一種6KD的分泌性蛋白，RT－PCR就顯示細胞中mRNA表達不高，估計將培養上清凍干濃縮后采用Western Blot還可能檢測不出，但如果用western，是否一定要用0.2μm的膜？用Tris-tricine SDS－PAGE電泳，電泳時分別管制三層凝膠，分離膠用40％
Western－Blot詳解（八）
DDDD.顯色目的條帶又細又淺，靶蛋白是27KD的bcl-xl和67KD 的c-myc，應該是高表達。每個涌道上50-70μg蛋白，開始用半干轉移，后來用濕轉14v，16h，用PVDF膜轉移。膠轉移后染色檢測，發現小分子量的基本轉移走了，可是為什么條帶老是不粗不濃呢?解答：可能跟你的一抗有關
Western－Blot詳解（二）
11、NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、過氧化物酶標記的第二
Western－Blot實驗步驟
實驗步驟： 1.分別配制 5%濃縮膠和12%分離膠 12%分離膠10mL 5%積層膠6mL H2O 3.3mL H2O 4.20mL 30% Acrylamide 4mL 30% Acrylamide 1mL pH8.8 Tris HCl（1.5M） 2.5mL PH6.8Tris
Western－Blot詳解－原理
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。?原理與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢
Western－Blot詳解（六）
GGG.我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不完全（電壓過小時間過短）或過度轉移（電壓過大時間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為Southe
Western－Blot操作步驟
背景： 蛋白質印跡的發明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被稱為Western Blot。最開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術
Western－Blot詳解（五）
CCC.Western Stripping Buffer的配方解答：METHOD11、stripping buffer: 62.5mmol/l Tris PH6.7；100mmol/l beta-mercaptoethanol；2%SDS二次發光protocol:1.stripping buffer
蛋白質免疫印跡（Western－Blot，WB－）——Western印跡法
實驗材料蛋白質樣品試劑、試劑盒裂解液PBSG 250考馬斯亮藍溶液NaClSDS上樣緩沖液電泳緩沖液轉移緩沖液麗春紅染液封閉液TBSTTBS洗脫抗體緩沖液顯影液定影液抗體化學發光試劑儀器、耗材高壓鍋玻璃勻漿器高速離心機分光光度儀-20℃低溫冰箱垂直板電泳轉移裝置恒溫水浴搖床多用脫色搖床實驗步驟一、操
western－blot－marker的作用
電泳后會顯示一個條帶,這個散開的條帶可以：1 在SDS-PAGE中監測蛋白的遷移；2 確認轉膜效率；3 根據marker的條帶估計分子量；4 確定目的蛋白位置.
western轉膜放置問題
1. 定義轉膜時與膠接觸的一面為“正”2. 封閉時使用封閉液，液體蓋過膜就好，所以無所謂正反3. 假如用暗室顯影法，將顯影的試劑與“正”面接觸，膠片與“正面”接觸4. 假如用熒光的話，理論上“正”面朝下，掃描，但實際操作過程中貌似都可以的
western－blot－marker的作用
電泳后會顯示一個條帶,這個散開的條帶可以：1 在SDS-PAGE中監測蛋白的遷移；2 確認轉膜效率；3 根據marker的條帶估計分子量；4 確定目的蛋白位置.
western－需要買什么試劑
試劑：tris、Hcl、Nacl、脫脂牛奶、甲醇、甘氨酸、tween 20、一抗、二抗、顯色劑及SDS PAGE需要的試劑（tris、Hcl、TEMED、SDS、過硫酸銨、丙烯酰胺、N N 甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、非預染蛋白Marker、甲醇、乙酸、考馬斯亮藍R250）、預染蛋白Marker耗材：濾
western－blot的實驗原理
Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品(跑PAGE 膠的原理你懂吧~~~)，轉移到固相載體（硝酸纖維素膜NC膜）上
western－blot－marker的作用
電泳后會顯示一個條帶,這個散開的條帶可以：1 在SDS-PAGE中監測蛋白的遷移；2 確認轉膜效率；3 根據marker的條帶估計分子量；4 確定目的蛋白位置.
Western－Blot主要試劑
主要試劑 1、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O**100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴格核實PH不得超過7.
western－blot－條帶怎么分析
把條帶圈出來然后點測量 就是measure 出來的那個mean的數值就是灰度 應該說是白度值 條帶越深數值越小
western－blot的條帶分析
你的對照組是什么？對照組有沒有出現問題？有問題的話是很可能是你在操作過程中有問題膜的質量是否有問題？
什么是western印跡技術
蛋白質經單向電泳后分離后被轉移到硝酸纖維濾膜上，然后用放射性或酶標記的特異抗體來檢測相應抗原的存在。蛋白質印跡技術是1975年Southern建立了Southern印跡法后，人們用類似的方法對蛋白質進行印跡分析，稱為Western印跡法。Western印跡法是將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺