PCR技術（十）：PCR產物克隆方法
平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效 率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為 3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR 產物的效率通過較高，。在采用大量T4DNA連接酶并配以5—10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19 的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組 子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法 克隆PCR產物。 粘端連接 引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互補堿基，因此可以在兩引物的5'末端設計單限制酶或雙限......閱讀全文
PCR產物純化方法
Purification of PCR Products in Preparation for CloningJoseph SambrookPeter Maccallum Cancer Institute and The University of Melbourne, AustraliaDavid
PCR擴增產物克隆的實驗要點
引物設計主要是要注意以下幾個事項： （1）發夾結構； （2）反向配對； （3）GC含量（40－60%）； （4）退火溫度（45－65度）； （5）引物長度（18－27bp）； （6）3' 端最好是C、G（提高結合度）； （7）引物在序列中的錯配位點。 大致就這幾個方面，重要性
克隆PCR產物的最優條件是什么？
最佳插入片段:載體比需實驗確定。1:1(插入片段:載體)常為最佳比,摩爾數比1:8或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑。室溫保溫1
克隆PCR產物的最優條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液，50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫
PCR產物常規純化方法
大批量、廉價、用于測序的PCR產物純化方法--PEG沉淀?最近，摸索了一下PEG沉淀PCR產物的方法，貼出來，與大家共享。?目的：探索一種方法，能將PCR產物大批量地、廉價地、純度比較高地純化出來，并且最好能去掉200bp以下的小片段DNA，用于DNA測序。?有文獻和方法說，不同濃度的PEG能沉淀不
克隆化的PCR產物連入T載體
由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本實驗來源「分子克
iPCR或混合PCR產物的SLIC亞克隆
實驗概要SLIC（Sequence and Ligation Independent Cloning）是一種不依賴于基因序列和連接反應的高效基因克隆新方法，它可以實現體外同源重組反應中多個DNA片段在單一反應中的裝配和單鏈的退火。實驗步驟1. 用限制性內切酶處理2微克載體，使用QIAEX II凝膠提
克隆化的PCR產物連入T載體
實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991
克隆化的PCR產物連入T載體
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 由 Taq DNA 聚合酶 PCR 擴增產生的帶 3' 突出端為 A 堿基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 載體上，這種 T 載體有與 A 堿基互補的未配對 3' T 堿基（Holton and Graha
PCR擴增產物的克隆——平端連接法
PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用
PCR產物的克隆（平頭連接和粘頭連接）
PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR 產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR 產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
關于克隆PCR產物的對照實驗相關介紹
A）涂布未轉化的感受態細胞。 如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。 B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。 例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋，1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，
PCR技術（九）：PCR擴增產物的電泳分析
凝膠電泳分瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種.一、瓊脂糖凝膠電泳: 瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡便、快速、最常用的分離純化和 鑒定核酸的方法.瓊脂糖是從海藻中提取的一種線狀高聚物.根據瓊脂糖的溶解溫度， 把瓊脂糖分為一般瓊脂糖和低熔點瓊脂糖.低熔點瓊脂糖熔點為62～65℃，溶解后在 37℃下維持液體
PCR實驗技術指南之產物測序
1. DNA 直接測序：指直接分析不經分離的PCR 擴增產物，如果各個位點上堿基序列都是一致的，則所得信號是確定的，否則，在那些有相異堿基的位點出現模糊信號， 如果模板在多數情況下被正確擴增，則少數的突變將被掩蓋，這是結果顯示的是模板的序列.但是，當擴增的前幾輪即出現錯誤擴增并被后續的循環積累，這時
PCR技術應用十：HIV感染
八十年代以來由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染而引起的艾滋病(AIDS)因其嚴重的危害性而受到人們高度重視，力爭早期診斷和尋求有效治療是防止其廣泛傳播的關鍵所在.聚合酶鏈反應(PCR)具有敏感、特異和快速的特點，是檢測病毒、評價病情進展和探討發病機理的有效工具.一、HIV的基因結構 HIV的基因
PCR產物的檢測方法有哪些
1.瓊脂糖凝膠電泳同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的2.酶切已知你產物的序列，看上面有什么酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行33.測序連接到pMD-18t
實驗分析方法PCR擴增產物
孔板夾心雜交法： 該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特 異雜交使產物的間接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一特異性較一次 雜交，漂洗后顯色即可判斷結果。該法需要兩個雜交過程來檢測 一個產物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法
PCR擴增產物的分析方法
擴增產物的測定有各種方法,如電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等,但臨床PCR檢驗項目基本上都使用探針雜交方法。雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適、標記方法不對、對探針的標記不夠、雜交或洗滌方法不合適等。最常使用的基因探針有:DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉錄的反義R
PCR產物的檢測方法有哪些
PCR產物的檢測方法：瓊脂糖凝膠電泳這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。?用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應
PCR產物的檢測方法有哪些
PCR產物的檢測方法：瓊脂糖凝膠電泳這是實驗室最常用的方法，簡便易行，只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時，由于泳動速度不同而被分離，經溴化乙錠（EB）染色，在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。?用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%，應
PCR－產物純化實驗
介紹一個采用 AmiconMicrocon-PCR 濾件（Millipore) 的方法，有效地去除冗余dNTP 和引物的方法純化 PCR 產物。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒TE 或去離子水PCR 產物儀器、耗材離心機和轉子PCR 濾 件微量離心管實驗步驟
PCR－產物定量實驗
測序之前對模板精確定量至關重要。根據 DNA 用量的多少，有幾種不同的方法可供選擇。下面介紹另外兩種方法：熒光測定法和比較溴化物染色法。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試劑、試劑盒DNA 標準TEPCR 產物儀器、耗材熒光計金屬箔紙微量離心管實驗步驟方法 A: 熒光測定
PCR產物污染誘因
PCR反應的zui大特點是不僅具有較大擴增能力而且還有著極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因（1）標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，
PCR－產物定量實驗
試劑、試劑盒 DNA 標準TEPCR 產物儀器、耗材 熒光計金屬箔紙微量離心管實驗步驟 方法 A: 熒光測定法熒光測定法可以在納克級范圍精確定量。熒光計和 DNA 定量試劑盒許多公司都有出售。確定熒光計是否安裝了適合于特定染料的激發和發射的部件至關重要。該方法在設計上適用于配有帶藍色 LED
PCR－產物純化實驗
試劑、試劑盒 TE 或去離子水PCR 產物儀器、耗材 離心機和轉子PCR 濾 件微量離心管實驗步驟 一、材料1. 緩沖液和溶液TE(lOmmol/L Tris-HCl，lmmol/L EDTA，pH7.5) 或去離子水2. 核酸和寡核苷酸待測序的 PCR 產物3. 離心機和轉子帶有固定傾角轉子的小型
PCR－產物純化實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 TE 或去離子水 PCR 產物 儀器、耗材 離心機和轉子 PCR 濾 件
PCR－產物定量實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 DNA 標準 TE PCR 產物 儀器、耗材 熒光計 金屬箔紙
PCR產物保存時間
未純化的PCR產物-20℃放上一周沒有什么問題。純化后若以干粉狀態可在-20℃保存好幾個月，若溶于Tris可保存一兩個月。注意不要用純水溶解。
簡述PCR－產物純化
PCR 反應完成目標 DNA 的擴增后，PCR 產物可以用于進一步的研究，例如用于 DNA 測序、克隆、分析基因的功能和表達等。然而，通過 PCR 反應后體系中仍然存在具有活性的 DNA 聚合酶，剩余的 dNTP、引物以及反應緩沖體系中的各種金屬離子等。因此，我們必須通過一定的方法從反應體系中提純
PCR技術應用基因克隆的應用
運用 PCR 技術、基因克隆和亞克隆比傳統的方法具有更大的優點。由于 PCR 可以對單拷貝的基因放大上百萬倍,產生微克(μg)級的特異 DNA 片段,從而可省略從基因組 DNA 中克隆某一特定基因片段所需要的 DNA的酶切、連接到載體 DNA 上、轉化、建立 DNA 文庫及基因的篩選、鑒定、亞克隆等