一、 試劑配方：
1X TBS: Tris-base 12.11g
Nacl 8.775g
用HCl 調pH7.4，用純水稀釋至1L
5X Transfer buffer: Tris-base 15.1g
Glycine 72.0g
To 1 L
10X堿性磷酸酶緩沖液： 1 mol/L Tris-HCl pH 9.5
1 mol/L Nacl
50mmol/L MgCl2
TTBS：1XTBS +TWEEN20（1000：1）
堿性磷酸酶顯色液：2.5mL 1X堿性磷酸酶緩沖液+16.5μL NBT混勻, 再加8.25μL BCIP混勻。
辣根過氧化物酶顯色液：10 mL 0.01 mol/L pH 7.6 Tris-HCl 溶解 6mg DAB，濾紙過濾（-20℃保存），顯色時加10μL 30%H2O2（即按1000：1加）。
二、實驗操作：
1、 SDS-PAGE，膠在電轉液：1 X Transfer buffer + 20%甲醇+ 0.01%SDS (800mL/800μL 10% SDS) 平衡10min。
2、 處理尼龍膜：100%甲醇浸泡 5min,再加4倍體積的雙蒸水，使甲醇終濃度為20%，浸泡5min。1 X Transfer buffer+20%甲醇（無SDS）浸泡10min。
3、 轉膜：按黑（—極）—海綿—濾紙—膠—膜—濾紙—海綿—白夾子（+極），（在電轉液：1 X Transfer
buffer+20%甲醇+0.01%SDS(800mL/800μL 10% SDS)中進行）夾好三明志夾，用冰包裹電泳槽，100V
或350mA轉70 min。（注意底部靠其下槽，排除氣泡，轉完后切角作標記）。
4、 封閉：電轉后膜用1XTBS漂洗1次，置于5%脫脂奶粉中（1XTBS+1000：1 TWEEN20），封閉過夜，或者37℃，30 min ~90 min。
5、 一抗：抗體（抗體稀釋比例根據自身實驗具體確定，推薦比例：抗血清常用1：100~1：5000 5%牛奶，培養液上清1：2~1：100，腹水1：200~1：10000 5%牛奶，），震蕩孵育1或2小時。（一抗可回收冷凍保存）
6、 TTBS 洗三次，10 min/次。
7、 二抗：1：1000~5000 TTBS稀釋（常用1：3000），室溫震蕩孵育1小時。
8、 TTBS 洗三次，10 min/次。
9、 顯色：將膜放在PARAFILM膜上，滴加顯色液5rpm（一般顯色1 min即可，注意控制好時間，否則顯色背景過深）。
10、純水終止顯色，晾干或濾紙吸干保存。