實驗方法原理 TRIzol 試劑是分離細胞和組織總 RNA 的即用型試劑，該試劑含有酚和硫氰酸胍單相溶液是 Chomczynski 和 Sacchi 進一步分離 RNA 方法的進一步改進。在勻漿或裂解樣本過程屮，TRIzol 試劑不僅可裂解細胞，而且可保持 RNA 的完整。加入氯仿后離心，溶液則分為水相和有機相，RNA 絕大部分保留于水相，RNA 轉到水相后，用異內醇沉淀以獲的 RNA，移去水相后，樣本中的 DNA 和蛋白質吋用連續沉淀獲得。用乙醇沉淀吋在中間相獲得 DNA. 異丙醇沉淀可在有機相獲得蛋白質。
該技術適于在人、動物、植物、細菌少量組織（50?l00 mg) 和細胞（5X104 ）以及大量組織（≥lg) 和細胞（5X107) 中分離 RNA，效果很好，整個過程可在 l h 內完成。用 TRIzol 試劑分離的總 RNA 沒冇蛋白質和 DNA 的污染，可用于 Morrhernblot 分析、斑點雜交、pdy(A) 選擇、體外翻譯、RNase 保護分析、分子克隆等。TRIzol 試劑易于分離不同大小分子質量的各 RNA，如從大鼠肝內分離的 RNA, 瓊脂糖電泳后，在 7kb 和 15kb 顯示出了不同的高分子質量的RNA 條帶，兩個主要的核糖體 RNA 帶在約 5kb (28S) 及約 2kb (18S) 處；低分子質量的RNA 0.1-0.3 kb (tRNA,5SRNA) .。分離的 RNA260/280= 1.6?1.8。每 mg 組織 RNA 的產置為：肝和脾，6?10 ug。腎 3?4 ug，骨骼肌和腦 1?5 ug，胎盤 1?4 ug。從 1X106 個細胞獲得 RNA 的量是：上皮細胞，8?15 ug；成纖維細胞 5?7 ug。現在已冇多種 TRIzol 類似產品可供使用。
試劑、試劑盒 氯仿 異丙醇 乙醇 無RNase的水 SDS溶液 TRIzol 試劑
實驗步驟
一 材料與設備
1)氯仿
2)異丙醇
3)75%乙醇（用DEPC水配制）
4)無RNase的水（將水加入無 RNase 的玻璃瓶內，加濃度為0.1 % ( V /V)的DEPC過夜 ，尚壓滅菌）
5)0.5%SDS溶液（必須DEPC處理過的高壓滅菌水配制 ）
6)TRIzol 試劑
二 操作方法
1 . 勻漿
1 ) 組織：每 50?l0 mg組織，加入1ml TRIzol試劑，用玻璃 -Teflcm 或電動勻漿器勾漿。樣本體積不能超過 TRIzol 試劑的10%
2 ) 單層培養細胞：在 3. 5cm 的培養皿中加入 1ml TRIzol 試劑?用吸管抽吸細胞多次，直接裂解細胞。加入 TRIzol試劑的量取決于培養皿的大小（1ml / 10cm2）而不取決于細胞的量。TRIZol 試劑的量若不足，分離的 RNA 易受 DNA 污染。
3 ) 懸浮細胞：離心收集細胞，加 入 TRIzol 試劑屮反復吹打裂解細胞。動物,植物,酵母每 5X106～10×106 個細胞用 lml TRIzol 試劑。加 TRIzol 試劑前請勿洗滌細胞，因為這樣會增加 RNA 的降解。可用勻漿器裂解細蔭和酵母細胞。
2 . 相的分離
1 ) 勻漿后于 15 ?30 ℃放置 5min，以保證核蛋白復合體完全分離。
2 ) 加入 0.2m l 氯仿 /lm l TRIzol試劑。蓋好樣本管于 15 ?30℃ 用手劇烈搖動 15s ，放置 2?3min。于 2?8° C 小于 12000 g 離心 10mm。離心后、混合物分為三相：即最下層紅色的酚-氯仿相，中間相以及上層水相& RNA絕大多數留于水相,水相體積用于勻漿的 TRlzol 試劑體積的 60%。
3. R N A 沉淀
1 ) 將水相移至一新管（若要分離DNA或蛋白質，保留有機相），加人異丙醇，混合均勻，以沉淀 RNA。每1ml TRizol試劑加入0. 5ml 異丙醇，于 15?30℃ 放置 10min
2)于2 ?8℃小于12000 g 離心 10min. 離心前，常看不到 RNA 沉淀，離心后 RNA 形成膠狀顆粒物.沉枳在管的底部和壁上。
4. R N A 洗滌
1 ) 移去上清液，用 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀一次，每 1mlTRIzol 試劑至少加入加入1ml7 5 % 乙醇混勻，于 2?8℃ 7500g 離心5min。
2 )棄上清
5.RNA溶解
1) RNA沉淀空氣干燥 5?l 0 min。勿在真空狀態下離心干燥RNA，并注意勿使 RNA 完全干燥，因為這會大大降低其溶解性。若RNA 未完全溶解，其 A260/280 <1.6
2 ) 加入不含 RNase 的水或 0.5% SDS 溶液，反復吹打以溶解RNAg 如RNA較難溶解，可于 55?60℃ 助溶 10min
注意事項
1)RNA 產量低：其原因可能有以下幾點：樣本未完全勻漿或裂解；RMA 沉淀未完全溶解。
2)A260/280＜1.65 其原因可能有以下幾點：樣本太少；勻漿后，標本未室溫放置水相受酚污染;RNA 沉淀未完全溶解。
3)RNA 降解：其原因可能有以下幾點：從動物中取出的組織未立即加工或凍存；分離 RNA 的樣本儲存于-5?一 20°C, 而不是一 60?一 70℃：; 細胞被胰酶消化；溶液或管中含有 RNase; 用于瓊脂糖凝膠電泳的甲醛 PH<3.L
4)DNA 污染：其原因可能有以下幾點：樣本太少；用于分離的樣本含有機溶劑如乙醇、DMSO) 雖緩沖液或堿性溶液。
5) 蛋白多糖和多糖的污染：下列改進的 RNA 沉淀法（步驟 3), 可從分離的 RNA 中去除這些污染物。水相中每毫升 TRIzolml 加入 0.25 ml 異丙醇，再加 0.25 ml 卨鹽沉淀液 (0.8mol/L 檸檬酸鈉 1.2mol/LNaCl), 混合，離心，如前所述。這樣可有效沉淀 RNA 而蛋白多糖和多糖則留在液相。
6) 從少量樣本 (細胞≤104 或組織≤10 mg) 中提取 RMA 時，加入 0.8 mlTRIzol 試劑，勻漿后，加入氯仿，進行 RNA 的分離，如步驟 2。用異丙醇沉淀 RNA 前，加入 5?10 微克無 RNase 的糖原。
7) 若樣本中含有高濃度的蛋白質 J 旨肪. 多糖或細胞外物質，肌肉、脂肪組織、植物莖塊，則需進行額外的分離。勻漿后，2?12000 g 離心 10 mm, 將不溶性物質去除所得的沉淀包含有細胞外膜、多糖和髙分子質量的 DNA，上清液則含有 RNA。來自脂肪組織的樣本，脂肪聚集在上層，可去除. 將處理好的勻漿液移至新管，如上所述，加氯仿進行液相分離.
8）勻漿后加氯仿前樣本可于-60?- 70℃ 儲存至少一個月。RNA 沉淀可在 75% 乙醇中 2?8℃ 放置至少一個星期，- 5?-20 ℃至少放置一年。
9) 若在步驟 2)、3) 中，離心轉速為 2600 g, 時間需增加到 20?30 min。
10)TRIzol 試劑有毒，若與皮膚接觸后，用清洗劑充分水洗。若感覺不適，應速去醫院。TRIzol 試劑儲存于 2?8℃ 若室溫儲存，有效期為 12 個月。