識別DNA末端：T4 DNA連接酶首先識別準備連接的DNA片段的末端。這些末端通常是通過限制性內切酶切割產生的，具有互補的單鏈尾巴（稱為黏性末端）或通過其他方式制備的平滑末端。
結合DNA：酶與這些DNA末端結合，形成一個酶-DNA復合物。
催化反應：在存在ATP或NAD+作為輔因子的情況下，T4 DNA連接酶催化DNA末端之間的磷酸二酯鍵的形成。這個過程需要能量，ATP或NAD+的水解提供了所需的能量。
釋放產物：一旦磷酸二酯鍵形成，連接酶從DNA上解離，釋放出連接后的DNA分子。
需要注意的是，T4 DNA連接酶可以連接具有互補黏性末端的DNA片段，也可以連接具有平齊末端的DNA片段，但在實驗室操作中，通常使用具有黏性末端的DNA片段，因為這種連接更為高效。此外，連接效率還受到多個因素的影響，包括DNA片段的濃度、緩沖液的條件、溫度等。