SouthernBlot雜交的原理、步驟及應用

原理
Southern印跡雜交技術是分子生物學領域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原 則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測方 法的靈敏性，綜合凝膠電泳和 核酸內切限制酶分析的結果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進一步構建出DNA分子的遺傳圖， 或進行目的基因序列的 測定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編 碼區的大小和位置。有關這類數據資料可應用Southern印跡雜交技術獲得。
步驟
　　1．瓊脂糖電泳
　　（1）取一定量的待測DNA樣品，用適當的限制性內切酶酶切。DNA的量根據樣品的種類及實驗目的的不同而異，對于克隆片段的限制性內切酶圖譜分析，取0.1-0.5μg即可；而對于鑒定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要10～20μg；當采用寡核苷酸探針或探針的比放射性活性較低時，則需要30～50μg。
　　（2）酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳。
　　（3）電泳結束后，EB染色，長波紫外線下觀察電泳結果及照相。
　　2．印跡轉移
　　（1）切膠并作標記（左下角切除），以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。
　　（2）將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h 使之變性，不間斷地輕輕搖動。
　　（3）將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30 min，不間斷地輕輕搖動。更換中和液，繼續浸泡15 min。
　　（4）將濾紙，硝酸纖維素膜NC膜(以下簡稱NC膜）剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉移buffer中平衡30 min。
　　（5）按右圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。
　　（6）虹吸轉移12-16h。
　　3．固定DNA
　　（1）取出轉移后的NC膜，用濾紙吸干NC膜，NC膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min。
　　（2）用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍，每遍5min。
　　（3）將膜夾在兩張干燥濾紙間，80℃烘烤1-2h。
　　4．預雜交
　　（1）將膜浸入5×SSC 中2min，將膜放入干凈的塑料袋中。
　　（2）將預雜交液事先在65℃ 預熱，然后將10 ml 預雜交液加入袋中，封口。
　　（3）65℃預雜交1h 以上，不時搖動。
　　5．雜交
　　（1）取出雜交袋，剪去一角去除雜交液后，加入5ml雜交液及5μl 變性探針，排除氣泡后封口。
　　（2）將雜交袋放入65℃ 水中雜交過夜。
　　6．按下列條件洗膜
　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室溫 5min /2次
　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
　　7．免疫酶聯檢測
　　（1）偶聯反應
　　①用中和液 洗膜2min，室溫。
　　②用封閉液50ml洗膜30min，室溫，輕搖。
　　③用中和液將稀釋抗體-Dig –Ap 至750 mU/ml ，將膜封入雜交袋，加入5 ml稀釋抗體輕搖50min。
　　④用中和液 50 ml洗膜，10min ×2次，室溫，輕搖，除去未結合的抗體。
　　（2）顯色反應
　　①用平衡液20 ml平衡膜2min。
　　②將膜裝入雜交袋中，加入5ml顯色液，避光30min 左右，當出現顏色時不要晃動。
　　③用TE洗膜終止反應。
　　④80℃烤干。
應用
遺傳病診斷，DNA圖譜分析，檢測樣品中的DNA及其含量，PCR產物分析等。