SDSPAGE蛋白質樣品的制備

SDS-PAGE Loading BufferddH2O30%丙烯酰胺混合液1.5M Tris(pH8.8)10%SDS10%過硫酸銨TEMEDTris-甘氨酸電泳緩沖液溴酚藍考馬斯亮藍 R-250 染色液考馬斯亮藍脫色液

離心機冷室水浴鍋電泳裝置微量移液器水平搖床濾紙

實驗過程

將收集的各樣品加入等體積的 2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解 5 min，冰浴 2 min，12,000rpm 離心 10 min，取上清-20℃ 保存備用。

SDS-PAGE 蛋白質電泳（參照分子克隆實驗指南操作）(薩姆布魯克,2002)

1）按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。

2）分離膠的制備

按下列成分配制 10 mL 12% 分離膠：
ddH₂O                                         3.3 mL
30% 丙烯酰胺混合液                   4.0 mL
1.5M Tris(pH8.8)                          2.5 mL
10%SDS                                      0.1 mL
10% 過硫酸銨                              0.1 mL
TEMED                                        0.004 mL
總體積                                         10 mL

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，并為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數次，用濾紙吸干凝膠頂端的水。

3）積層膠的制備

按下列成分配制 2 mL 5% 的積層膠：
ddH₂O                                           1.4 mL
30% 丙烯酰胺混合液                     0.33 mL
1.0M Tris(pH6.8)                            0.25 mL
10%SDS                                        0.02 mL
10% 過硫酸銨                                0.02 mL
TEMED                                          0.002 mL
總體積                                           2 mL

各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避免產生氣泡。

4）待積層膠凝固后，小心拔下梳子。

5）將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的 1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入 20μL 各樣品。

6）樣品在積層膠中電泳時，使用 80V 電壓，待溴酚藍帶進入分離膠后，將電壓升至 120V，繼續電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源。

7）卸下凝膠，將其浸泡在至少 5 倍體積的考馬斯亮藍 R-250 染色液中，置水平搖床上室溫染色至少 4 h，之后取出染色的凝膠并回收染液，以備再用，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液中，在水平搖床上脫色 4~8 h，其間更換脫色液 3~4 次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結果并拍照。