RiboPrinter?在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用（一）

RiboPrinter? 在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用
  梭狀芽孢桿菌是一個多樣化的革蘭氏陽性菌屬，專性厭氧，在環境中普遍存在。這個屬大約包含了100多個種，基因組內總體的G+C含量范圍在22-55%，反映出該屬內的細菌在系統進化關系上的巨大差異。 該屬內最主要的食源性致病菌為肉毒梭菌和產氣莢膜梭菌，它們均可通過毒素介導，通過直接產生毒素（如食源性肉毒中毒），或在腸道內生成毒素（如嬰兒肉毒中毒和產氣莢膜梭菌腹瀉），從而引發食源性細菌性疾病。
  肉毒梭菌簡介 肉毒梭菌（Clostridium botulinum）屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌，為革蘭氏陽性的多形態大桿菌，芽孢位于菌體近端，使菌體呈匙形或網球拍狀。根據抗原性的不同，肉毒梭菌可分為8個型，分別是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。 肉毒梭菌產生的外毒素稱為肉毒神經毒素（BoNTs，botulinum neurotoxins），肉毒毒素在目前已知毒素中毒性最強，一個人的致死劑量大約為1 μg，比氰化鉀毒力大10000倍，和炭疽一樣，可作為生物武器。BoNTs可引發食物中毒，即肉毒中毒，能夠引起人類中毒的主要型別為A、B和E型。肉毒中毒的臨床表現不同于其他食物中毒，胃腸道癥狀很少見，主要為神經末梢麻痹，發病率不高，但死亡率居細菌性食物中毒之首。 肉毒梭菌是一種腐物寄生菌，在自然界分布廣泛，食物中肉毒梭菌主要來源于環境，如塵埃、糞便等，尤其是帶菌土壤。肉毒梭菌的抵抗力一般，在45℃以上都受到抑制，80℃經20min可被殺滅。但其芽孢的抵抗力極強，可耐煮沸長達1-6h之久，于180℃干熱5-15min或于120℃高壓蒸汽下10-20min才能滅活，在酒精中可存活2個月，10%的HCl需60min才能破壞芽孢。蛋白分解型的肉毒梭菌（A、B和F型）芽孢比非蛋白分解型的B、E和F型的芽孢對熱具有更強的抵抗力。芽孢在厭氧環境的食品中可發芽繁殖產生肉毒毒素，人類因食入已產生毒素的食品而發生肉毒中毒。另外，因肉毒梭菌隨蜂蜜等食物進入嬰兒腸道內產毒引發的嬰兒肉毒中毒也有存在。   肉毒梭菌的形態特征和分類學


肉毒梭菌為多形態的厭氧性的桿狀菌，長約4-6?m，寬約0.6-1.2  ?m，兩側平行，兩端鈍圓，直桿狀或稍彎曲，可形成芽孢，卵圓形，位于次級端或偶有位于中央，常見很多游離芽孢，多單在，偶見成雙或短鏈，A型和B型菌的芽孢大于菌體，位于菌體近端，使菌體呈匙形或網球拍狀，其他的型芽孢一般不超過菌體寬度。有時呈現長絲狀或鏈狀，有時能見到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線狀和染色較深的球莖狀，這些屬于退化型，當菌體開始形成芽孢時，常常伴隨著自溶現象。肉毒梭菌具有4-8根周生性鞭毛，運動遲緩，沒有莢膜。
  根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》，肉毒梭菌歸屬為原核生物界、厚壁菌門、厚壁菌綱、芽孢桿菌科的梭菌屬（Clostridium）。
  肉毒梭菌這個種是基于單一的表型特征，即產生BoNTs的這個特性來分類定義的。Collins等（1998）又將其分為4個組（Group  I-IV），這些群呈現出非常多樣化的基因型和表型特征（見表一），菌株之間的差異程度要遠遠超過枯草芽孢桿菌（Bacillus  subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株之間的差異程度。
  這種情況有時更為復雜，導致分類學上的困難，因為有些菌株從發育關系上來說與肉毒梭菌非常相近，但是并不產生神經毒素，因而沒有歸入肉毒梭菌這個種，如生孢梭菌（Clostridium  sporogenes），諾維氏梭菌（Clostridium  novyi），和其他一些未命名的梭菌；而有些菌株能生產神經毒素，卻因系統發育較遠，并未歸入肉毒梭菌，如巴氏梭菌（Clostridium  baratii）以及酪酸梭菌（Clostridium  butyricum）。更復雜的情況是，Collins等（1998）還發現BoNTs的毒力基因能在菌株間不穩定地平行轉移，從而產生不產毒的變種，或是攜帶部分或未知的BoNTs基因。正因為肉毒梭菌的種內多樣性，導致了對于該細菌的分類學研究仍存在爭議，給各種肉毒梭菌的檢測、分離和鑒定方法，甚至是16S測序法鑒定都帶來了一定的難度。
  表一：肉毒梭菌的基本特征

 肉毒梭菌的傳統鑒定和分離方法

正如前述，肉毒梭菌這個種是基于單一的表型特征，即產生BoNTs的這個特性來分類定義的，所以傳統的表型和基因型鑒定方法，如生化反應、細胞脂肪酸組分分析以及16S測序等并不能給出明確的鑒定結果，見Collins（1998），Brett（1998），Ghanem（1991）。比如，16S測序方法已被證實無法區分肉毒梭菌及其兩個近親：諾維氏梭菌（Clostridium  novyi）和生孢梭菌（Clostridium sporogenes）。
  肉毒梭菌培養分離的第一步是增菌培養基及培養條件的確定。培養基可優先選用預還原性（Pre-reduced）厭氧無菌的熟肉基質培養基（可含或不含葡萄糖成分）（cooked  meat medium），碎肉葡萄糖淀粉培養基（chopped-meat glucose-starch  medium），或胰蛋白胨葡萄糖酵母提取肉湯（tryptone-peptone glucose yeast extract  broth）。胰蛋白酶可被添加到配方中以滅活細菌素和激發神經毒素。溶菌酶的加入有助于復活熱損傷的孢子，尤其適合于非蛋白分解型肉毒梭菌的菌株。
  由于不同組別的肉毒梭菌的最適生長條件并不統一（見表一），所以最優的培養溫度的選擇仍然是個問題。Solomon（2001）等推薦采用28℃用于II組肉毒梭菌的培養，而用35℃用于其他組別的培養，不過目前已經有質疑認為其不適用魚類和貝殼類食品中肉毒梭菌的檢測。Anon（1998）等推薦采用30℃用于所有組別的菌株的培養，但在這個條件下I組的菌株得不到最優的生長。
  培養5天后，接種的肉湯需做小鼠生物實驗（Mouse Bioassay）以檢測BoNTs的產生情況。另需培養10天以檢測受損芽孢或延遲產芽菌株的生長情況仍然是十分必要的。所有的培養物還需最終通過鏡檢檢測，觀察菌株的形態特征，以獲得鑒定結論。
  疑似陽性的肉湯樣本，連同疑似原因食品和臨床樣本（尤其是糞便）還需選用上述培養基進行嚴格厭氧環境下的二次培養以進行確認。培養基需包含以下成分： 卵黃：以檢測酯酶陽性的肉毒梭菌菌株，見Silas（1985） 選擇性抗菌劑：環絲氨酸，磺胺甲基異惡唑，甲氧芐啶等，見Silas（1985），Dezfulian（1981），Mills（1985） 由于肉毒梭菌不同組別菌株存在較大差異（尤其是I組和II組），專家們一致建議采用含抑菌劑和不含有抑菌劑的選擇性平板同時進行對照實驗，以便分析和獲得更為準確的結果。
  典型的肉毒梭菌的菌落形態見圖一： Typical colonial growth of C. botulinum, together with an atypical  lipase negative culture: Classically, C. botulinum colonies are usually  gray-white on blood containing agars with circular irregular edges, and a  clear zone of β-hemolysis.
Clostridium botulinum growing on blood agar （Below Left） Clostridium botulinum growing on egg yolk agar showing the lipase reaction after 72 hours of incubation （Below Right）

  主要的肉毒梭菌的生化特征見表二和表三： 表二：各型肉毒梭菌的生化特性