RNAseq綜述（九）

通過研究RNA分子內的相互作用來研究RNA的結構

核糖體RNA和tRNA構成細胞的大部分RNA。它們與其他結構非編碼RNA一起在細胞中發揮各種作用，例如從基因調節到翻譯。現存主要有兩種研究RNA結構的方法：基于核酸酶的方法和化學探針方法。核糖核酸酶消化于1965年首次用于研究RAN(tRNA(Ala))的結構。在接下來的40年中發展了化學方法，例如，通過引物延伸的選擇性2?-羥基酰化法(selective 2?-hydroxyl acylation analysed by primer extension, SHAPE)，此種方法用于在單堿基分率水平上檢測tRNA(Asp)的結構。但是，只有將各種核酸酶法和化學方法與RNA-seq相結合，才能使方法從單一RNA轉移到全轉錄分析，這正在改變我們對結構復雜性和重要性的理解。在這里，我們集中討論核酸酶和化學分析方法之間的主要區別(圖·6a)，如果想對這方面有進一步的理解，可以看Strobel在這方面的綜述。

核酸酶方法，例如RNA結構的平行分析法(Parallel Analysis of RNA Structure，PARS)和片段測序法(fragmentation sequencing, FRAG-seq)，這兩種方法使用能消化單鏈RNA(ssRNA)或雙鏈RNA(dsRNA)的酶。核酸酶消化后剩余的RNA用作RNA-seq的文庫構建。隨后通過對產生的RNA序列數據進行計算分析來識別結構化(雙鏈)和非結構化(單鏈)區域。核酸酶易于使用，可以用于研究ssRNA和dsRNA，但是由于核酸酶消化法的隨機特性，它們與化學分析法相比，分辨率比較低。此外，由于核酸酶尺寸比較大，這就限制了這些核酸酶進入細胞，這就使得它們不適合體內研究。

化學分析法使用與RNA分子反應的化學探針，來標記結構化或非結構化核苷酸。這些標記要么阻斷逆轉錄，要么導至cDNA的錯配，從而可以定位并分析RNA-seq讀長，用于揭示結構組。SHAPE之后進行測序，這種技術方法能夠RNA骨架上的核糖2’-羥基反應來標記未配對的ssRNA，雖然發夾環中的堿基折疊會降低其效率。Structure-seq與硫酸二甲酯測序(dimethyl sulfate sequencing, DMS-seq)能使用DMS來標記腺嘌呤和胞嘧啶殘基，阻斷逆轉錄，最終從生成的截短cDNAs分析中推斷出RNA結構。SHAPE和突變表達譜(SHAPE and utational profiling, SHAPE-Map)和DMS突變表達譜測序(DMS-MaPseq)都修改了實驗條件，從而提高了逆轉錄酶的加工能力，并防止cDNA截短。相反，化學標記會導至錯配事件，在RNA-seq數據的分析中，能夠檢測出這些“突變”，從而揭示RNA結構。化學探針是小分子化合物，盡管由于細胞內的環境處于動態變化中，數據有可能更加多變，但是化學探針還是能夠用于研究活體內的有生物學意義的結構。化學探針還可以用于nascent RNAs的結構分析，并揭示共轉錄RAN折疊的順序。

核酸酶和反轉錄阻斷方法通常產生短RNA片段，并且只報告單個酶切位點或化學標記，而錯誤結合和突變檢測方法可以報告每個讀長的多個化學標記。沒有方法不存在偏倚；逆轉錄阻斷永遠不會100%有效，本應誘導突變的化學標記可以阻斷cDNA合成，這兩個因素都可以影響數據的解讀。Spike-in控制有可能改善結構組分析的質量，但尚未得到廣泛使用。SHAPE方法的比較揭示了僅在體內實驗中才會出現效率差異，因此這就突顯出比較類似復雜方法時所需要謹慎。

這些方法正在產生關于RNA結構如何在基因和蛋白質調控中發揮作用的新理解。例如，DMS分析說明了，RNA結構有可能調控APA，或許會減慢催化活性區域的翻譯，使得更多的時間用于蛋白質的折疊，從而減少錯誤折疊事件。結構RNA-seq方法的結合有可能產生所有的完整結構組信息。隨著該領域的擴展，我們可能會發現，RNA的結構與疾病的進展和或疾病的狀態有關；最近的結果表明，異常RNA結構在重復擴張性疾病方面可能發揮作用。最終，結構組分析也許會促進那些靶向作用于研究透徹的RNA結構的小分子的開發，從而開辟治療開發的新領域。

研究分子間RNA-RNA相互作用

分子間的RRIs在轉錄后調控中發揮著重要作用，例如miRNA與靶基因的3’UTR結合。現在已經開發了用于研究分子間RRI的工具，它們用于靶向分析和轉錄組分析。這些分析方法含有一個共同的工作流程，即RNA在打斷與鄰位連接之前，通過交聯來保護其相互作用(FIG. 6b)。大多數并非全部，由不同方法嵌合生成的嵌合cDNA來源于穩定堿基配對（即相互作用）RRNA分子的連接。靶向方法，例如交聯，連接和雜交物測序(Crosslinking, ligation and sequencing  of hybrids, CLASH)， RNA相互作用組分析和測序(RNA interactome analysis and sequencing, RIA-seq)和RNA反義純化方法測序(RNA antisense purification followed by RNA sequencing, RAP-RNA)能產生一個RNA或RNA家族的高深度相互作用圖譜。CLASH豐富了使用IP來進行特定蛋白復合物介導的RRI分析方法，而RIA-seq使用反應寡核苷酸來回收那些與靶基因有相互作用的RNAs；這兩種方法都無法區分直接和間接的RRIs，這就導至其生物學解釋變得復雜。為了提高RRI分析的分辨率，RAP-RNA使用補骨脂素(psoralen)和其他交聯劑，然后用反義寡核苷酸捕獲RNA，以及使用高通量RNA-seq來檢測直接和間接RRI。雖然該方法可以進行更具體的分析，它需要制備多個文庫（每個交聯劑一個文庫）。

轉錄組方法從根本上類似于靶向方法：相互作用的RNA在體外被交聯后并被富集。通過減少進入連接反應的非相互作用RNA的量來提高富集的特異性，并且可以通過2D凝膠純化(如在RNA相互作用和結構的補骨脂素分析(psoralen analysis of RNA interactions and structures, PARIS)或交聯RNA的生物素親和純化(如在補骨脂素交聯，連接和選擇的雜交測序， sequencing of psoralen crosslinked, ligated and selected hybrids,SPLASH)來實現，或者通過RNase R酶的消化來清除非交聯RNA(如在相互作用的RNA連接之后的RNA-seq, ligation of interacting RNA followed by RNA- seq， LIGR-seq)。連接后，在進行RNA-seq文庫制備前，去除交聯，然后進行測序。PARIS能夠生成所有方法中最高數目的相互作用次數，但是每個樣本需要75M的讀長，這些任何其他的RRI方法都多，并且所需要的DGE實驗平均讀長深度是其他實驗的2倍。

對整理好的RNA相互作用數據的分析可以對多個相互作用進行可視化，并些這種分析方法已經提示了RNA各類的RRI分布的變化。總之，90%的RRIs涉及mRNAs。近一半涉及miRNA或長鏈非編碼RNA，對于這些RNA，大多數相互作用都與mRNA靶基因相關。對這些整理數據的比較揭示了不同方法對特定RNA物種的偏倚，這導至這些方法之間幾乎沒有重疊。因此，繪制RRI的完整圖譜可能需要使用不止一種方法。然而，RRI方法有幾個局限性。也許最具挑戰性的就是RRI是動態的，并受結構構象和其他分子間相互作用的影響，這使得在沒有重復的情況下，很難對其進行解釋。分子內的相互作用為分子間的RRI分析增加了干擾，這就需要過濾并除去那些高度結構化的RNAs，例如rRNAs。其它的問題還包括RNA提取過程中相互相互作用的打斷，這就需要穩定的交聯方法，但最常用的RRI交聯劑是補骨脂素和4’-氨基-甲基三氧沙林(4?-amino- methyltrioxsalen, AMT)，這些交聯劑只交聯嘧啶，其效率比較低，會降低靈敏度。此外，鄰近連接步驟低效，并且這會連接相互作用和非相互作用RNA，進一步降低靈敏度。

研究RNA-蛋白質相互作用

ChIP-seq已經成了繪制和研究DNA-蛋白質相互作用不可或缺的工具；類似的IP方法也用于研究RNA-蛋白質的相互作用。RNA-蛋白質相互作用方法依賴于IP，利用針對感興趣的RNA結合蛋白的抗體來捕獲其結合的RNA進行分析（第一次報道時是用芯片進行分析的）(FIG. 6c)。各種RNA-蛋白質相互作用方法之間最明顯的區別在于相互作用的RNA和蛋白質是否交聯以及如何交聯：一些方法避免交聯(天然IP， native IP)，其他方法使用甲醛進行交聯，一些方法使用紫外線(UV)光進行交聯。最簡單的方法就是RNA免疫沉淀測序(RNA immunoprecipitation and sequencing, RIP-seq)，時常，但并非所有情況下都使用天然IP法，以及并非總進行RNA打斷。這種簡便性使用該方法易于被采用。這種方法能產生有用的生物學信息，但是它有兩個重要的缺陷。第一，用于保存RNA-蛋白質相互作用的前提是需要進行溫和地洗滌，這就意味著富集的片段中有相對高的非特異性結合片段。第二，沒有進行RNA打斷就降低了結合位點的分析。因此，RIP-seq具有高度靈活性，并依賴于RNA-蛋白質結合的自然穩定性。使用甲醛交聯在RNA與其相互作用的蛋白質之間產生可逆的共價鍵提高了穩定性，并減少了非特異性RNA的回收，但甲醛也會導至蛋白質-蛋白質的交聯。這種影響可以通過使用0.1%的甲醛（比ChIP-seq研究使用的甲醛低10倍）進行溫和的交聯來降低，這能在多個蛋白質靶點上產生高質量的結果。

在CLIP中使用254nm的UV來進行聯系是一項關鍵的技術，它提高了RNA-蛋白質相互作用分析方法的特異性和位置分辨率。UV交聯在蛋白質和RNA的相互作用位點產生共價鍵，但最重要的是，它不對蛋白質-蛋白質相互交聯。這就穩定了RNA-蛋白質的結合，允許嚴格的富集，破壞了天然RNA-蛋白質的相互作用，減少了背景信號。CLIP的實驗方法隨后就構成了許多方法發展的基礎。單個核苷酸分辨率的CLIP(iCLIP)將UMIs整合到文庫中，用于移除PCR復制。它還利用了cDNA合成在交聯核苷酸處常見的過早截短，通過對截短的cDNA進行擴增來獲得交聯位點的定量，核苷酸級分辨率圖譜。光激活核糖核苷增強片段(Photoactivatable- ribonucleotide-enhanced CLIP,PAR-CLIP)通過使用4 sU和356nM的UV來進行交聯。在細胞培養過程中，4 sU被整合到內源RNAs中，356nm的UV輻射會在4 sU整合位點處產生交聯（產生高度的特異性）。在產生的測序數據中檢測反轉錄誘導的T>C替換就會能夠實現堿基對級的分辨率，并且能夠區分交聯片段和非交聯片段，進一步降低背景信號。最近對CLIP的改進提高了它的效應和靈敏度。紅外CLIP(infrared CLIP, irCLIP)用紅外凝膠成像技術來代替放射性同位素檢驗，它是基于珠子的純化技術。與常規的iCLIP使用的1百萬到2百萬細胞相比，這些技術的改進可分析只有2萬個細胞的RNA-蛋白質相互作用。增強型CLIP(enhanced CLIP, eCLIP)拋棄了RNA-蛋白質復合物的質控和可視化操作，而是在RNA接頭中添加了條形碼，這種改進可能讓所有的樣本混合到一起，并用珠子來代替了凝膠。這些改進旨在簡化實驗操作，eCLIP實驗已經研究了近200個蛋白，它已經成了ENCODE項目的一部分。但是，irCLIP與eCLIP目前都沒有被廣泛采用，部分原因是eCLIP和irCLIP的靈敏性增加的原因是由于其特異性降低導至的，比如利用兩個方法所鑒定的PTBP1結合位點上結合或有序和調節外顯子的富集減少。隨著公共數據庫中可用的大量數據為計算分析提供了新的機會，因此謹慎考慮CLIP數據的質控，過濾，以及峰值調用(peak calling)和歸一化方法就變得非常重要，這些會影響數據的生物學解釋。為了更全面地討論 RNA-蛋白質的相互作用的CLIP實驗方法，我們建議讀者可以閱讀最近關于這個主題的綜述。

一些RRI以及所有的RNA-蛋白質結合方法對IP的依賴限制了其對有良好特征抗體蛋白質的研究，而非特異抗體的結合仍然是一個問題（雖然這一問題并非局限于這個領域）。RNA結構也會影響RNA-蛋白質之間的相互作用；一些蛋白質能識別特異的RNA二級結構或與這些結構競爭結合RNA，這使得體外的發現轉向體內就變得復雜了。此外，結構和RNA-蛋白質相互作用方法通常報告一個特定轉錄本或位置的平均值。在實驗室方法中，在計算方法和單分子測序方面的未來發展或許有助于破譯一些這些生物變異。

結論

Wang，Gerstein和Snyder關于RNA-seq將“革命性地[如何]分析真核轉錄體”的預測肯定是正確的。但是，即使是他們，也有可能對這種轉型的規模感到驚訝。現在我們可以分析RNA生物學的許多方面，這對于基因組功能、研究開發和確定導至癌癥和其他疾病的分子調控異常方面來說是必不可少的。雖然生物學發現階段還遠未結束，但是已經在臨床中使用了RNA-seq方法。單細胞測序正在成為許多實驗的標準配置，空間轉錄組學的分析可能會遵循類似的路徑，使其能夠在與開發當前方法的實驗室范圍之外使用。長讀長測序方法也有可能取代當前相當大比例的研究者們默認選擇的Illumina的短讀長RNA-seq。對于這種情況的出現，長讀長測序技術還需要在增加通量和降低錯誤率方面做出極大的改進。然而，長讀長mRNA異構體測序的優點是，如果它變得像現在短讀長測序一樣便宜和可靠，那么對于那些除了易降解材料外，長讀長測序就可能是首選。考慮到這些因素，那么任何關于RNA-seq在未來十年可能如何發展的預測都有可能過于保守。