RNAi：制備siRNAs的方法

越來越多的研究人員開始采用小分子干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs)來抑制特定的哺乳動物基因表達。siRNA是一種短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾途徑（RNA interference pathway）。RNAi的應用包括功能基因組學，藥物靶篩選，細胞信號傳導通路分析等等。
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括
· 化學合成
· 體外轉錄
· 長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
· siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
· PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
前面3種方法包括體外制備siRNAs然后經過轉染或者電轉導入哺乳動物細胞后面兩種方法則依賴能夠表達siRNAs的DNA載體或者表達框轉染到細胞中。每種方法都有自己的優點和缺點。哪種是最好的方法，其實取決于實驗目的。這里簡單介紹這5種方法，優點和缺點，以及它們最適合的應用。
siRNA的設計
除了方法3以外，其他的方法都在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列。關于怎樣設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，盡管我們不斷掌握越來越多有關設計原則的信息。但這仍然不是精確的。通常來說，每個目標序列設計3—4對siRNAs，在后面的實驗中選擇最有效的那個。網上有提供免費的siRNA設計工具。
體外制備
1.化學合成
盡管化學合成是最貴的方法，但是卻是最方便的——研究人員幾乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
最適用于：已經找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究
不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素
2.體外轉錄
通過體外轉錄的方法可以合成siRNAs，這樣的成本相對化學合成法而言比較低，是一種性價比高的篩選siRNAs的好方法。更重要的是采用這種方法能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNA Construction Kit為例，一旦得到DNA Oligo模版（這個還是需要DNA合成的，不過DNA合成的成本就比較低了），只要24小時就可以，不需要等很久。這個方法的不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當的時間——畢竟，化學合成只需要定購就可以了。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學合成siRNAs較高濃度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ，圖2）
最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。
不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

Figure 2. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs to Induce Gene Silencing. siRNAs targeting ?-Actin were prepared by chemical synthesis (Ambion) or by in vitro transcription using Ambion's Silencer? siRNA Construction Kit. HeLa cells were plated at 30,000 cells per well in a 24 well tissue culture plate containing glass slides. The cells were transfected 24 hours after plating, using 2 μl siPORT? Lipid (Ambion) according to the manufacturer's protocol, at a final siRNA concentration of 75 nM. Immunofluorescence analysis was performed 96 hr post transfection using mouse anti-Human ?-Actin primary antibody and a FITC conjugated anti-mouse IgG secondary antibody. Photographs were taken using the appropriate fluorescent filters and quantified using MetaMorph software. Note that both siRNA preparation methods resulted in >_ 95% reduction in ?-actin protein levels