1995年，康奈爾大學的Su
Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達，他們對這個結果百思不得其解。直到1998年，
Andrew
Fire的研究證明，在正義RNA也阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA[1]。這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的。這種雙鏈
RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預（RNA
interference,RNAi）。隨后的研究中發現，RNAi現象廣泛存在于線蟲，果蠅，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內，這些生物體利用RNAi
來抵御病毒的感染，阻斷轉座子的作用。RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內，RNAi能達到基因敲除的效果。在小鼠和人的體外培養細胞中利用RNAi技術也成功阻斷了基因的表達，實現了細胞水平的基因敲除。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展，它被《Science》雜志評為2001
年的十大科學成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，發現它在基因表達調控中發揮重要作用，它也名列2002年《Science》雜志評的十大科學成就之首。
一. RNAi的機理
目前RNAi的作用機理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內闡明的。生物體內的雙鏈RNA可來自于
RNA病毒感染，轉座子的轉錄產物，外源導入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發了細胞內的RNAi機制，結果是病毒被清除，轉座子的表達被阻斷，外源導入基因表達被阻斷同時，與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。
㈠ 參與RNAi反應的酶
RNA酶Ⅲ是一種能切割雙鏈RNA的酶，參與RNAi反應的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一個成員。
Dicer酶廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動物體內。它的結構中包括一個螺旋酶結構域，兩個RNA酶Ⅲ結構域，一個雙鏈RNA結合位點。在
Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個核苷酸的片斷，稱為siRNA（short interference
RNA）[2]，它啟動了細胞內的RNAi反應。
由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應可以傳遞到子代細胞中，研究者們推測細胞內存在
RNAi效應的擴增系統。研究者們發現，在真核細胞中也存在能以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA
polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，進入細胞內的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程，呈指數級的數量擴增。
㈡ RNAi的反應過程
雙鏈RNA進入細胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白[3]。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在
RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈[4，5]。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的
siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的
siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。
二. 哺乳動物細胞中的RNAi
在小鼠的胚胎細胞中也存在RNAi，將727個堿基對的雙鏈RNA轉入小鼠的畸胎瘤細胞，誘發了細胞內的RNAi機制，并抑制了報告基因的表達[6]。但大于30個核苷酸的雙鏈RNA進入哺乳動物的成體細胞后，會非特異的阻斷基因的表達。這是由于當長的雙鏈RNA進入哺乳動物成體細胞后，細胞內的病毒防御機制被激活。細胞內干擾素產生增加，蛋白激酶PKR激活，使轉錄因子E2F被抑制，非特異的阻斷基因的轉錄，并誘導細胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNase
L)被激活，產生非特異的mRNA降解。而未分化的胚胎細胞中，上述防御病毒的機制存在缺陷，因而 雙鏈RNA能特異的阻斷基因的表達。
由于大于30個核苷酸的雙鏈RNA非特異的阻斷哺乳動物成體細胞中的基因表達，RNAi在哺乳動物成體細胞中的應用受到限制。但Tuschl等人的研究工作克服了這一障礙。他們發現，21個核苷酸的雙鏈RNA能夠誘發哺乳動物細胞內的RNAi機制，同時不會激活細胞內的干擾素
[7]。他們合成了以熒光素酶的mRNA為靶分子的21個核苷酸的雙鏈RNA，將它和熒光素酶的表達質粒用脂質體共轉染到NIH3T3,COS-
7,Hela
S3,293細胞中，報告基因的表達被抑制了90%。由于報告基因得到的結果不能完全說明細胞內的情況，他們又合成了細胞內源性基因laminA/C為靶目標的雙鏈RNA，這個雙鏈RNA也特異的抑制了laminA/C的表達，抑制率達到90%以上。
根據一條mRNA的不同靶位點可以合成出許多條雙鏈RNA，研究發現這些雙鏈RNA的作用差別很大
[8]。其中轉錄起始位點，編碼區的3’末端為靶點的雙鏈RNA的效果很差。而GC含量低的區域似乎雙鏈RNA的效果好。線蟲內的siRNA可以作為引物，以靶mRNA為模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量擴增siRNA。將siRNA的3’末端標記上FITC使它喪失引物的作用，在將其轉入哺乳動物細胞內，它抑制靶基因的作用并沒有受到影響。因而研究者推測，哺乳動物細胞內不存在象線蟲那樣的依賴于RDRP的RNAi放大機制。在哺乳動物細胞中瞬時轉染dsRNA后，dsRNA的作用只維持了三天。而將表達dsRNA的載體轉入哺乳動物細胞后篩選出的穩定表達株中，在轉染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表達[9]。利用載體表達出的dsRNA為發夾結構，其環狀部位的核苷酸的序列和數目對dsRNA的作用都有影響，研究者發現9個核苷酸比5個或7個核苷酸的效果好[9]。DsRNA的作用很強，在1nM時就能有效的阻斷靶基因的表達。RNAi還具有很高的特異性。19個核苷酸的
dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的一個核苷酸突變掉后，它對基因的抑制作用就消失了[9]，這對dsRNA的應用是非常重要的，這可以避免dsRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。
三. 雙鏈RNA的構建
雙鏈RNA可先在體外構建好，然后轉染細胞。在體外構建雙鏈RNA時，分別在體外轉錄出正義和反義
RNA，再將兩者退火，形成雙鏈RNA。體外合成的雙鏈RNA可以用脂質體轉入細胞中。但有些細胞脂質體轉移效果差，轉移到細胞內的雙鏈RNA半衰期短。而先在體外構建能表達雙鏈RNA的載體，再將載體轉移到細胞內在細胞內合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉染細胞的種類，而且在長期穩定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發揮阻斷基因的作用。