如今NGS已能夠快速經濟地閱讀數億個reads，所及之處遠超越基因組學（如RNA測序使轉錄組學發生革命性變化）。盡管NGS取得了諸多進步，但依然存在一些重大的挑戰。日前，牛津大學舉辦的“NGS七周年大會”聚焦了NGS面臨的挑戰，此次會議闡述了NGS領域最令人生畏的障礙，同時也闡述了跨越這些障礙的技術。
本次會議中提及的NGS的新突破點包括毒性、RNA-Seq文庫及可變剪接圖譜中的多余轉錄組的去除以及線粒體DNA測序。如今NGS在線粒體DNA測序領域取得了一定的進展，線粒體在疾病發展中的作用逐漸被認識，然而這些細胞器中的DNA測序十分復雜，因為線粒體具有相當大的遺傳復雜性和異質性。NGS的另一個突破點為腫瘤異質性分析，長期以來腫瘤分析都被異質性困擾著，但幸運的是，異質性腫瘤樣本可通過排序程序將病變細胞從總群體中分離出來，且這些細胞群更適合測序。
消除毒性轉錄組（Toxic Transcripts）
InDA-C技術效應圖
創建高特性的RNA-Seq文庫仍面臨著長期的挑戰，NuGEN Technologies技術總監 Luke Sherlin博士說，“減少不必要轉錄組如rRNA、球蛋白以及其他管家類的轉錄組，同時保持總RNA群中的必要轉錄組十分有必要。” NuGEN Technologies公司開發了新技術來實現這個目標，他們在RNA-Seq文庫構建的過程中，利用InDA-C（Insert-Dependent Adaptor Cleavage ）方法（使用特定的酶）來消除文庫中多余的轉錄組序列，這種方法與雜交捕獲方法形成對比。“InDA-C是一種靈活的方法，容易應用于各種不同的物種如人類、小鼠、大鼠、果蠅和擬南芥等”，Sherlin說，“InDA-C技術是一種相對較新的方法，可提供一種獨特的方式來構造任何物種的無偏差的RNA-Seq文庫，且定制步驟方便簡單。”
可變剪接和RNA-Seq數據庫
RNA-Seq技術還提供了一個寶貴的工具來破譯轉錄組的可變剪接。有些基因的一個mRNA前體通過不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點）產生不同的mRNA剪接異構體，這一過程稱為可變剪接(或選擇性剪接， alternative splicing) 。可變剪接是調節基因表達和產生蛋白質組多樣性的重要機制， 是導至真核生物基因和蛋白質數量較大差異的重要原因。
霍普金斯大學醫學院遺傳醫學研究所Liliana Florea教授表示，“人類基因組計劃10年前創建了剪接變異初始圖譜，但該圖譜仍不完整，仍欠缺包含所有可變剪接的存儲庫。每個剪接變異體的編目帶來的挑戰是令人畏懼的，但RNA-Seq技術可深入分析細胞和組織的轉錄組，提供一種可詳細描述可變剪接的技術手段。但RNA-Seq仍然很難準確拼湊長異構體所產生的小片段。
Florea教授報告稱，她和她的同事們決定開發適用于RNA-Seq數據的計算機系統，“我們決定開發其他程序無法達到的算法來確定二次變異。”使用這種工具，她希望能夠明確可變剪接是如何發生以及如何隨細胞類型發生變化。該研究團隊曾利用Illumina公司的Body Map dataset建立每個組織的可變剪接的綜合目錄，該目錄囊括了16個組織的25億個序列，被用于不同組織的比較。然而這種比較是一個艱巨的任務，為了保持比較的精度，研究人員依賴于內部軟件套件SpliceBox，該研究小組發現，超過60%的發現是新的，包括新的外顯子、新的內含子等。
“這種方法可對現有的變異注釋數據庫進行補充，還可為可變剪輯的進化和發展提供新的見解”， Florea教授強調，“但更多的RNA-Seq分析需要進一步評估，我們希望更多的實際應用，包括臨床測序、基本分子生物學、癌癥研究、甚至包括植物基因組學。”
線粒體DNA測序
異質性混合物從母親遺傳給后代
線粒體，這些神奇的細胞體，不僅產生ATP供應能量，還與人體罹患癌癥、心臟病和糖尿病的風險有關。西奈山醫院腫瘤學教授Ravi Sachidanadam博士引領的研究證實了這些觀點。Sachidanadam教授表示，“真核細胞有兩個基因組——核DNA（nDNA）和線粒體DNA（mtDNA），雖然線粒體的活性取決于上千個蛋白質，這些蛋白主要由核DNA編碼，但由線粒體DNA編碼的蛋白（大約13個以上）也扮演了關鍵的角色。”
線粒體DNA測序不是一件小事，因為每個線粒體攜帶了多個線粒體基因組（5-10個），且每個細胞擁有成百上千的線粒體。Sachidanadam博士承認，準確編目線粒體DNA多樣性是一項挑戰，雖然線粒體DNA豐度不及總DNA的1%，但它在細胞之間多重復合，同時核DNA測序結果經常被線粒體DNA混淆。
為了克服這些挑戰，Sachidanadam博士及其同事開發了一種稱為MSeek的線粒體測序技術。Sachidanadam博士說，“將線粒體孤立起來相當苦難，我們的方法包括通過耗盡線性核DNA及廉價測序來凈化線粒體DNA，MSeek可產生高純度的線粒體DNA（>90%），所達的靈敏度和特異性前所未有，這個方法是凈化和檢測線粒體DNA的新方法。”
該研究團隊所取的重大突破是確定了核酸外切酶V是消化核DNA的最佳酶，該酶同時可保持線粒體DNA圓形完好無損。Sachidanadam博士補充說，他們利用Illumina公司的Miseq測序平臺來展開這個試驗，并計算假基因的含量。
使用MSeek技術，該研究團隊得到了一個驚人的發現，“我們不僅證實了異質性無處不在（多個線粒體DNA單倍體的存在），我們還發現了異質性可作為細胞類型的識別指紋，此外我們還發現細胞之間可互相交換線粒體DNA，這影響了單個細胞中線粒體DNA的穩定性。”
Sachidanadam博士說，“我們團隊現研究成果僅僅是MSeek技術所揭露的一小部分，雖然MSeek技術目前面臨的局限為所需的DNA總量至少為4ug，我們預計該技術將被應用到其他領域中，不僅包括治療，還包括取證等。
從FFPE中分離出純的腫瘤細胞
根據Silicon Biosystems首席商務官Raimo Tanzi博士，腫瘤分析通常因為異質性而存在困擾，數字分析方法的引進，如NGS和數字PCR可助于梳理少數的腫瘤樣本，然而只有均質抽樣才能提供最清晰的解釋。為了解決這些問題，Silicon Biosystems應用了新的數碼技術（DEPArray?）從異構的腫瘤樣本中分離出純細胞群，該半導體技術基于在CMOS芯片上利用雙向電泳（DEP）將單細胞與單級電泳結合。
Tanzi博士說，“FFPE樣本最初先被轉化為細胞懸濁液，并被給予適當的標記，之后置于一次性的微流控盒中，一旦處于流動細胞狀態，每個細胞先被CMOS芯片控制電極捕獲，然后被顯微鏡掃描并獲得熒光圖像。根據這些圖像，每個細胞被識別為特定的類型（腫瘤、基質等），最終同種類型的細胞純度在100%。”
新技術可將幾十到幾百個純細胞從細胞池中分離出來并用于全基因組分析。細胞池中可能包括上皮-間充質轉化細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞和間質細胞。Tanzi博士說，“DEPArray是第一個自動化技術可從異構的FFPE樣本中分離出純的細胞，這給許多研究帶來了好處，其中包括一些與癌癥相關的研究，如樣品的均勻性、明確識別拷貝變異數、雜合子丟失等。該技術的另一個可能用途是進行非常小的樣本的遺傳分析，包括細針穿刺標本和腫瘤低細胞結構的遺傳分析。”顯然，研究人員在NGS領域取得了令人興奮的進展，未來應該有更快、更精確、更新穎的技術。
提高文庫制備的性能
文庫制備是NGS的重要部分，成功的測序需要高質量的文庫來產生足夠的收益。由于測序技術的提高以及范圍的擴大都受文庫建設的推動。高性能的分析是十分必要的，包括低輸入量以及低質量樣本或包含極端CG含量樣本的分析。同時需要協議來保證文庫的質量。新英格蘭生物實驗室研究人員表示他們最近重新研制了NEBNNextUltra DNA工作流程中的試劑配方，為Illumina創建 NEBNext Ultra II DNA文庫制備試劑盒（NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit）。根據NEBNext開發組組長Eileen Dimalanta博士，新的試劑能使客戶克服了文庫制備面臨的挑戰，如復雜的樣品類型，FFPEDNA、樣本中CG含量的統一以及PCR循環數等。