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    發布時間:2020-09-07 16:29 原文鏈接: RNAExtraction(miniprep):Trizol法實驗原理和步驟

    RNA的制備與分析對于了解基因在轉錄水平上的表達與調控和cDNA的合成都是必須的,RNA的純度和完整性對于Northern blot,RT-PCR 和cDNA文庫的構建等分子生物學實驗都至關重要。RNA分離的方法很多,其中最關鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染

    實驗原理:
     Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑,在勻漿和裂解過程中,能在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后,RNA處于水相中,將水相轉管后用異丙醇沉淀RNA。
    用這種方法得到的總 RNA中蛋白質和DNA污染很少,可以用來做Northern,RT-PCR,分離mRNA,體外翻譯和分子克隆等。

    實驗步驟:
    1.液氮研磨樣植物葉片,每1.5ml tube分裝0.1克樣品;
    2.每管加1毫升Trizol 試劑(樣品體積不超過Trizol 試劑體積的10%),迅速混勻(若樣品較多可先將混好的樣品置于冰上);室溫下凈置5-10分鐘以利于核酸蛋白質復合體的解離;

    7. 棄上清,加1ml 75%乙醇清洗RNA,振蕩片刻后(務必使沉淀懸浮起來,以確保洗滌干凈),7500×g 離心5分鐘,小心棄上清;
    8.室溫靜置5-15分,使RNA沉淀恰好干燥,加入20 μl DEPC水溶解,取2 μl 瓊脂糖電泳檢測RNA質量。采用分光光度計測定RNA濃度,將樣品保存于-70 ℃超低溫冰箱中備用。

    注意事項:
    抽提及操作RNA中要謹防 RNase的污染,因此操作RNA的試劑及器皿都要進行相應的處理。
    RNase- free water:Draw water to RNase- free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate (DEPC)to 0.01% . Let stand overnight and autoclave.
    研缽處理:0.4N NaOH 浸泡過夜,DEPC水洗滌3遍;
    應戴口罩和手套,環境潔凈;玻璃器皿180oC烘烤3hrs以上;塑料制品DEPC水清洗,蛋白質變性劑處理;一次性用品如tube,tip等用新的,高溫高壓消毒。


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