RNA的提取和純化實驗

試劑、試劑盒 氯仿焦碳酸二乙酯乙醇異丙醇苯酚-胍鹽單相溶液磷酸鹽緩沖液

儀器、耗材 離心機和轉頭移液器離心管錐形管平板勻漿器

實驗步驟

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

氯仿

焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的 H20(GenHimterR105)

乙醇

70% 乙醇洗液（用 DEPC 處理過的 H20 配制）

異丙醇

苯酚-胍鹽單相溶液（推薦 RNApure,GenHunterP501-P503)

磷酸鹽緩沖液（PBS)

2. 離心機和轉頭

小離心機

3. 專用設備

50 ml 錐形管

1.5 ml 小離心管

1000ul(原文為 ml。—譯者改）移液器

100~150 mm 平板

P10 移液器

Pdytron 勻漿器（用于從組織中提取 RNA)

二、方法

第一步：RNA 提取

方法 1: 從組織培養物中提取 RNA

1. 如果細胞貼在瓶壁或平板上，則倒掉培養基，將平板置于冰上。

2. 如果細胞是懸浮的，旋轉離下細胞，并除去培養基。

3. 用 10~20 ml 的冷磷酸鹽緩沖液（PBS) 漂洗細胞。

4. 倒掉 PBS，并用 1000ul 移液器吸去殘留的 PBS。

5. 每 100~150 mm 平板加入 2 ml 苯酚-胍鹽單相溶液（RNApure)，以裂解細胞（搖晃平板使溶液分布均勻）。這個體積足夠裂解 100 萬~1000 萬個細胞。

6. 將平板放在冰上 10 min。

7. 將裂解液吸到兩個標記好的 1.5 ml 離心管中。

方法 2: 從組織中提取 RNA

1. 在裝有組織的 50 ml 錐形管中，加入至少 2 ml 苯酚-胍鹽單相溶液（RNApure), 并置于冰上。組織和酚溶液的理想比例至少應該是 1:10。

2. 用 Polytron 勻漿器將組織攪勻，直到組織完全分散為止。

3. 將管子置于冰上10min。

4. 取 1ml 裂解液，分裝到標記好的 1.5 ml 離心管中。

方法 3: 從血液中提取 RNA

1. 將血液產品離心，并除去血漿。

2. 按照上面從組織中提取 RNA 的說明逬行操作。

第二步：RNA 的純化

1. 每毫升裂解液加入 150ul 氯仿，渦旋混勻 10min。

本方案可以在此處停止，并將裂解液放置在-80°C

2. 在 4°C 以最大轉速離心 10min。

3. 小心地將上清液轉移到一個干凈的、標記好的 1.5 ml 離心管中。

4. 加入等體積的異丙醇，并在冰上放置 10min，然后劇烈地混勻或渦旋混勻 30s。

5. 將混合物在 4°C 以最大轉速離心 10min。

6. 用 1ml 預冷的 70% 乙醇（用 DEPC 處理過的 H20 配制）洗滌 RNA 沉淀，在 4°C最大轉速離心 2 min。

7. 倒掉乙醇。短暫離心后，用移液器吸去殘留的洗液。

8. 將 RNA 在 5ulDEPC 處理過的 H20 中重新懸浮。

注意：如果 RNA 用于任何擴增反應，懸浮液中不要使用 SDS。

9. 取1ul RNA(用 P10 移液器）測定濃度，用1ml H20 稀釋。在 260nm 下讀數，注意 1OD260=40ug。