PCRSSCP技術檢測細菌

長期以來，臨床上主要用細菌培養和血清學方法檢測病原菌，但均不能達到快速診斷細菌感染的目的。常規PCR技術采用針對特定病原菌的特異性引物，由于臨床病原菌往往不明，需用多種不同引物和擴增程序進行PCR擴增，亦難實現快速診斷。PCR-SSCP技術主要用于基因突變的檢測，利用該技術鑒定細菌雖有報道[1，2，3]，但都限于臨床菌株，未與標準菌株為對照。本研究采用細菌共有的16SrRNA基因的保守區引物作為通用物。對幾種常見的細菌進行PCR擴增，SSCP分析PCR產物，并以標準菌株為對照，旨在達到快速檢測不同細菌的目的。

1. 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種：

　　大腸埃希菌(ATCC25922)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由中國藥品生物制品檢定所提供。溫州醫學院附屬二院檢驗科分離保存的臨床株—肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、甲型副傷寒沙門菌、產氣腸桿菌、洛菲不動桿菌。

1.1.2 引物：

　　引物設計參照文獻_[3]進行，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，經鑒定為電泳純。

1.1.3 主要儀器和試劑：

　　Beckman GS—15R離心機，Perkin Elmer ?DNA擴增儀，DYY—Ⅲ型穩壓電泳儀為北京六一儀器廠產品，Taq DNA聚合酶、dNTPs、100bp DNA? Ladder對照購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA制備：

　　DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，主要步驟如下：菌株于血平板上37℃培養過夜，挑取0.5cm大小的菌落懸浮于200μl ?TE中，再加入400μl裂解液、3μl蛋白酶K混勻，55℃水浴1小時。加入600μl氯仿混勻，10000轉／分離心2min。取500μl上層清夜移至1.5ml離心管中，加入500μl沉淀液混勻，室溫放置2min，10000轉／分離心2min。吸去上清液，立即加入100μl的1.2mol／L? NaCl，輕輕振蕩至DNA樣品完全溶解，加入3μl ?RNA酶A，37℃ 10min，再加入300μl預冷的g無水乙醇，-20℃放置10min，10000轉/分離心4min。吸走乙醇，用70％乙醇洗一次。倒置室溫干燥10min，100μl? TE溶解DNA。
1.2.2? PCR擴增：擴增體積50μl：10×buffer(包括Mgcl2)5μl ，20mmol／L dNTPs 1μl ，5U／μl Taq酶0.2μl，5μl模板DNA，各引物2.5μl，無菌去離子水補足體積。擴增條件：94℃1min，56℃1min，72℃30s，擴增30個循環。
1.2.3? SSCP分析：取5μl PCR產物，與等量變性上樣緩沖液(5mmol／LEDTA(PH8.0)，0.05％溴酚藍，0.05％二甲苯氰，95％甲酰胺)混勻，99℃熱變性10min后，迅速置冰水浴中不停振蕩10min，10μl處理產物全部上樣，干預電泳1小時的8％非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳(電泳槽置于4℃冰箱中)。電泳條件 ：1×TBE,4℃，16mA4h。

1.2.4 銀染：

　　凝膠10％乙醇固定10分鐘，1％硝酸作用4min，水洗2次，0.2％硝酸銀(新鮮配制)染20min，水洗3次，3％碳酸鈉顯色10min，最后用10％醋酸終止反應。

2. 結果

2.1 一對引物P11P—P13P擴增產物SSCP結果(見圖1)：

　　洛菲不動桿菌、金黃色葡萄球菌SSCP圖譜呈多態性，與其他細菌可相互區別；另外5種細菌SSCP圖譜無多態性，較難區別。

2．2兩對引物(P11P-P13P，ER10-ER11)擴增產物SSCP結果(見圖2)：

　　細菌的SSCP圖游呈多態性，單鏈條帶區條帶數目、相對遷移率及條帶之間的間距存在明顯差異，各細菌之間可相互區別。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的標準菌株與臨床菌株的SSCP單鏈條帶區圖譜完個一致。

3.討論

　　16SrRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在于所有細菌的染色體基因中，也存在于衣原體、立克次體等原核生物中，但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守，但其保守性是相對的，在保守區之間存在著9或10個變異區，保守區和可變區互相交錯排列，不同細菌都有不同程度的差異，可設計不同引物對所有細菌或特定細菌進行PCR檢測[4]。利用PCR技術擴增16SrRNA基因，可早期判斷是否存在細菌感染，進—步分析擴增產物鑒定病原菌的種屬，彌補了細菌培養和血清學檢測的不足。目前主要是將兩條引物設計在16SrRNA基因保守區成為通用引物，首先確定是否存在感染，然后在中間的特異區中選擇序列做探針進一步鑒定細菌_[4,5]，除了需PCR擴增外，還要進行探針雜交，較為復雜且費用高。李雷等_[6]采用細菌16SrRNA基因通用引物，分別通過半套式PCR和套式PCR對不同細菌的DNA進行擴增，以檢測細菌，需要兩次擴增，較復雜且增加了污染的機會。另外有學者根據16SrRNA基因設計寡核苷酸引物，再將擴增產物進行DNA測序分析_[7]，序列分析非常特異和準確，但費時且費用高，臨床上難以推廣。

　　SSCP技術可區分由少至一個堿基的改變而導致的構型改變，主要用于檢測基因突變_[8，9]，不同細菌間的16SrRNA基因序列都有不同程度的差異，可采用SSCP進行分析。本實驗發現利用一對引物時，有5種細菌的SSCP圖譜無多態性，難以相互區別，與文獻_[1，2]報道的有差異，這可能與選擇的引物序列不同有關。加入兩對通用引物后，擴增出16SrRNA基因中的1173—1389bp和103—357bp區域的靶DNA序列，由于這兩對引物位于有種屬特異性的可變區的兩側，擴增出的PCR產物有種屬特異序列，單鏈DNA的遷移率是序列依賴性的，故各菌的SSCP圖譜呈多態性，差異明顯，且其差異與親緣關系成正比，可能是由于親緣關系越近，16SrRNA基因的同源性越大，造成單鏈的構象越相似。本實驗還發現，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)與金黃色葡萄球菌的標準菌株和臨床菌株的圖譜也相同，說明該技術難以區別相同細菌的不同耐藥性。SSCP圖譜中，在單鏈條帶區前面的200-300bp之間的條帶為變性不徹底的殘留的雙鏈PCR產物。理論上講，一對引物的單鏈PCR產物在SSCP電泳時表現兩條單鏈帶_[10]。但在本實驗發現，一對引物的圖譜中有的反而只有一條單鏈帶；加入兩對引物后，有的為5條甚至6條單鏈帶。

　　本實驗不需要探針，加入兩對通用引物，只需一次PCR擴增，整個過程只需十小時左右；同種細菌的標準菌株與臨床分離株的SSCP圖譜完全相同，若將不同細菌的標準菌株的SSCP圖譜存人數據庫作為模式圖譜，將臨床病原菌的SSCP圖譜與之比較，可簡便、快速、特異、敏感地檢測細菌，尤其適用于臨床無菌部位如血液、腦脊液的病原菌檢測。在實驗過程中要注意每一環節都嚴格無菌操作，避免出現假陽性結果。