1. 樣品的收集：待測細胞用無雙抗培養基培養7d，用無菌容器取上清液500μl，4℃保存待測。
2. 模板的制作：在無菌的條件下，取細胞培養上清液100μl于一無菌的0.5ml塑料離心管內，蓋好蓋子，95℃水浴加熱5min。
3. 打開蓋子，向管內加StrataClean樹脂10μl，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5——10s，吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢，4℃保存。
4. PCR反應：
反應體系最適條件為：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.38），50mmol／L KCl，1.5——2.5mmol／LMgCl2，200 μmol／L dNTP，2U Taq DNA聚合酶；總反應體系為50μl，反應用去離子水均需用12000μJ／cm2紫外燈照射。
（1）在0.5ml塑料離心管中加入35.2μl去離子水及5μl 10×Taq反應緩沖液。
（2）依次加入下列成分：0.4μl dNTP（25mmol／L）；0.4μl Taq酶（5U／μl）；2μl引物。
（3）加2μl去離子水，總體積45μl。
（3）加2μl去離子水，總體積45μl。
（4）加5μl已制成的模板到反應體系中。
（5）陽性對照、內對照各5μl加入到各自的反應體系中。
（6）取1支含有以上反應體系的離心管，加入5μl去離子水作為陰性對照管。
（7）在反應體系中加入100μl礦物油。
（8）PCR程序
程序1： 94℃ 2min、50℃ 2min、72℃ 2min，1個循環；
程序2： 94℃ 1min、50℃ 1min、72℃ 2min，共40個循環。
5. 瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度2％。電泳結束后，凝膠成像分析結果。
6. 實驗結果及分析：
該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上，Marker（DNA分子質量標準參照物）、陽性對照、內對照均會出現不同的電泳條帶。當被檢樣品泳道出現明亮條帶，且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間，即可認為該樣品被支原體污染。有時還會發現一條泳道出現多條，可能是該樣品感染2種以上支原體所致。 展開 | 