進化遺傳學具有兩個并列的研究方向：系統發育的重建和種群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白質序列和基因序列的比較可以象分子種一樣用于標志 現存物種分化的時間以來，各種生化方法被用于系統發育的研究。在最初二十年內， 同功酶的電泳分析、免疫學比較和蛋白質序列分析被廣泛地應用。而最近，DNA-DNA 雜交和核糖體RNA序列分析為分類學做出了重要貢獻。這些技術大多有局限性，因為 它們是估計而不是直接測量序列的差別。
那些把注意力集中在同功酶的分析及細胞核和細胞器DNAs限制圖譜分析上的種群 生物不需要具有更高分辯率的方法。直到如今，要獲得比幾個典型生物更多的序列數 據都是不現實的。在篩選克隆文庫、制作克隆子的圖譜及測序上所需的努力過大，以 至對特定物種進行更多的個體檢測是不可能的。聚合酶鏈瓜在克服了用于進化研究的 傳統DNA分析法的局限性。
通用引物
初看，對序列了解得不夠好象限制了PCR的應用，因為對序列的某些了解是設計 PCR引物所必需的。幸好，有一種獲得新物種引物序列的快速方法。通過選擇廣泛保 留在不同物種中的序列，可設計出通用引物，用于擴增一個特定細胞核或細胞器的基 因片段，此基因片段可取自一個較大類群的絕大多數成員，如：植物或真菌。這就把 系統發育的序列比較分析范圍擴展到了綱或門的分類水平上。而且此法對鑒定標本和 劃分生物類型在種群中的位置起重要作用。基于這些目的，線粒體DNA（mtDNA）序列 較適用。下面，我們詳述對于細胞核及線粒體序列均適用的通用引物。線粒體基因法 是一個精確的檢測方法；因為mtDNA進化非常快，設計此分子的引物會發生困難。
核基因引物
撏〝引物的概念在大量的_°?_RNAs直接測序中已使用多年。那些相同的引物極易 配對，通過PCR擴增核糖體DNA序列。rDNA擴增具有幾個超過rRNA直接測的優點。首 先，DNA可作為起始物質，而用從組織中制備DNA比制備RNA容易。第二，樣品用量更 少。最后，用各種測序酶及技術進行的DNA測序可用來從兩鏈上獲得數據并繞過核糖 體RNAs復雜的二極結構對其進行測序。
例如，我們設訐的引物可擴增許多真菌、原生動物、藻類、植物及動物的 18SrDNA上約515bp的片段（擴增區加引物約為555bp）。引物NS1和NS2的設計依據為 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Dictyosteliumdiscoideum和 Stylonichiapustulata 18S rDNA 中的保守核苷酸序列，這在其它地方也有詳述。
NS15'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'
NS25'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3'
NSl和NS2在本章敘述的實驗條件下不擴增細菌或線粒體rRNA基因。NS1和NS2擴增 片段的序列差異（對某些生物是長度的差異）有助于對分子分化進行初步估計，即在 有各種生物的自然群中決定不同的物種數量。這些引物也可用于檢測在提取自動物或 植物組織的原始DNA中是否有真菌DNA的污染。Medlin及其助手詳述了可擴增低等真核 生物完整的18s基因的其它引物，這些引物對于此類生物的系統發育研究比NS1和NS2 更有用。
線粒體DNA引物
對線粒體基因序列的研究適于解決許多在進化及種群生物學中的問題。因線粒體 在脊椎動物中進行無性繁殖遺傳，它是重建母性系統發育的理想模型。其高速率的點 突變進化使它成為在種間進行高分辯率的種群研究的典型，其在物種中突變的迅速固 定也使其分子成為物種鑒定的理想依據，尤其是對小型生物而言。
因脊椎動物mtDNA進化速率非常快（約為核基因的10倍），尋找保守序列作為PCR 的啟動位點會很困難。圖1所示為擴增細胞色素b基因上一個370bp區段（擴增片段為 376bp）的兩個引物的位置。經檢測，細胞色素b存在于大多數脊椎動物（哺乳類、鳥 類、爬行類、兩棲類和魚類）。引物Ll4841和Hl5149在已發表的核苷酸序列的保守區 上。字母L和H表示mtDNA的輕鏈與重鏈，數字表示引物3'堿基在已發表的人類完整 mtDNA序列上的位置。
圖1在脊椎動物線粒體基因組的共有結構中細胞色素b的保守引物位置。此分子編 碼13種蛋白質、22種tRNA。調控區也叫D-環，在細胞色素b及12srRNA基因之間。Koche 等詳述了mtDNA上其它的保守引物區。
Ll48415'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3'
Hl51495'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3'
我們使用截短了的這些引物也成功地擴增了哺乳動物、鳥類及兩棲類的DNA。引 物MVZ3和MVZ4的序列如上圖劃線部分，可擴增311bp區段（擴段片段366bp）。
細胞色素b基因上的序列含有高分辨率的系統發育信息并且在生物類群中存在范 圍極廣。因蛋白質結構及作用保存得相當完整，序列定位容易進行，親緣關系近的可 通過因密碼子中不活動位點的轉換而發生的變化來估計，親緣關系遠的則可通過分析 顛換差異或替代氨基酸來檢測。
方法
DNA制備
自消化過的組織中提取DNA，組織在100mMTrispH8.0，10mMEDTA，100mMNaCl， 0.1%SDS，50mMDTT，0.5μg/ml蛋白酶K緩沖液中37℃消化幾小時。DNA用酚抽提兩 次，用酚/氯仿（1:1）提純一次，再用氯仿提純一次，純化的樣品經離心透析或乙醇 沉淀進行濃縮。
DNA擴增及測序
擴增在100μl反應液中進行，反應液含有67mMTrispH8.8，6.7mMMgSO4，16mM硫 酸銨，10mMβ巰基乙醇，四種dDNP各1mM，兩種引物各1μM，10-100ng基因組DNA，及 2.5單位TaqDNA聚合酶（PerkinElmer/Cetus）。聚合酶鏈反應的每個循環包括93℃變 性1分鐘，50℃退火1分鐘及72℃鏈延伸2-5分鐘。此循環重復25-40次，具體次數依 DNA模板的起始濃度而定。取5μl擴增混合物在2%瓊脂糖凝膠（NuSieve，FMCCorp.） 上電泳，電泳緩沖液為40mMTris-乙酸（H8.0），用溴化乙啶染色。
將含有擴增產物的膠帶切下，溶于1ml蒸餾水，用1μl此溶液作為第二次鏈反應 的模板，制備用于測序的單鏈DNA。在第二次反應中，兩種引物中的一個濃度減少100 倍。經40個擴增循環后，經2-4次重復離心透析除去游離核苷酸及鹽。DNA用商品試劑 盒進行測序，用第二次鏈反應中被減少的那個作引物。
技術注意事項
通過提高些有機體DNA的退火溫度，可改進擴增產物的特異性及產量。在一個引 物比例為50:1的35個循環的單鏈PCR反應中，增加后的特異性可使單鏈DNA模板直接由 起始模板產生。改進后的反應所用dDNP濃度降低（每種為32μM），循環參數為：在 93℃起始變性3分鐘，然后進行35個循環，即93℃變性25秒，55℃退火25秒，55℃退 火25秒，72℃鏈延伸2分鐘。在線狀期增加72℃鏈延伸時間可增加用于測序的單鏈模 板的產量。上述循環參數與引物NSl及NS2聯用擴增真菌DNA可除去在圖2第1道中所出 現的多余條帶。
對于許多不同個體或生物中相同基因的擴增及測序研究，必須嚴格地避免在DNA 分離及制備擴增產物時出現交叉污染。在配制PCR反應液時，只能使用帶活動槍頭及 活塞的吸量器。用一擴增DNA的吸量器決不能再用于組織DNA的分離或在另一輪擴增前 稀釋DNA。不含DNA而含有所有其它試劑及稀釋劑等的對照要包括在每次實驗中，以檢 測污染。在極端環境下，需要更換引物用以擴增靶基因上的一個不同的序列并用新吸 量器來進行DNA分離或配制PCR反應液。
結果
圖2顯示了用從各種生物中提取的5ng總DNA及引物NS1和NS2擴增rDNA的一個片段 的結果。約560bp的主要DNA擴增產物可從所有的被測生物樣品中看到，但其在長度上 有一些小差別。因這些引物適用范圍廣泛，它們可用于共生筆物的檢測。例如，一旦 獲得一組菌根真菌和其宿主植物的序列數據，就可用種特異性DNA探針來檢測及鑒定 在自然種群中的單個共生對。
mtDNA引物用于擴增多種生物的細胞色素b區段。圖3顯示了五種脊椎動物的細胞 色素bmtDNA序列定位。這些序列即顯示了引物的通用性又顯示了其定位的同線性。盡 管有顯蓍的序列錯配，引物仍可用于人類、鼠和牛mtDNA的擴增（圖4）。
圖2用NS1和NS2作引物的核小亞基rRNA基因片段的擴增結果。除退火溫度為45℃ 外，擴增反應條件、電泳及溴化乙啶染色觀察方法見《實驗方法》一節中所述。 1.Laccariabicolor一種菌根擔子菌，2.Alderglutinosa，3.果蠅（Drosophilamel anogaster）4.Anelosimusexinius，一種蜘蛛，5.Tyromycesunicolor，一種擔子菌 rDNA重復單元的克隆質粒DNA。6.不含DNA的陰性對照7.空格8.標準分子量參照物（P hiX174RFHaeⅢ）
TGLFLAMHYSPDASTAFSSIAHITR25
HumanACAGGACTATTCCTAGCCATGCACTACTCACCAGACGCCTCAACCGCCTTTTCATCA ATCGCCCACATCACTCGA75
sheepACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACAACAGCATTCTCCTCT GTAACCCACATTTGCCGA75
ChickenACCGGCCTAGTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCTTCTCCT CCGTAGCCCACACTTGCCGG75
saiamanderACAGGGTTATTTTTAGCTATACATTATACAGCAGATACATCATCAGCATTCT CATCCGTAGCCCACATTTGCCGA75
FishACAGGCCTTTTCCTAGCCATACACTATACCTCCGACATCGCCACCGCCTTTTCCTCCG TCGCCCACATCTGTCGT75
DVNYGWIIRYLHANGASMFFICLFL50
HumanGACGTAAATTATGGCTGAATCATCCGCTACCTTCACGCCAATGGCGCCTCAATATT CTTTATCTGCCTCTTCCTA150
SheepGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGATAAATACACGCAAACGGGGCATCAATATT TTTTATCTGCCTATTTATG150
ChickenAACGTACAATACGGCTGACTCATCCGGAATCTCCACGCAAACGGCGCCTCATTC TTCTTCATCTGTATCTTCCTT150
SalamanderGATGTAAATTATGGTTGACTTATACGAAATATTCACGCAAACGGCGCTTCA TTCTTTTTTATTATTATCTTTCTT150
FishGACGACGTCAACTACGGTTGACTCATCCGAAATATGCACGCCAACGGCGCATCCTTC CTCTTCATTTGTATTTAC150
HIGRGLYYGSFLYSETWNIGIILLL75
HumanCACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACTCAGAAACCTGAAACA TCGGGATTATCCTCCTGCTT225
SheepCATGTAGGACGAGGCCTATACTATGGATCATATACGTTCCTAGAAACATGAAACAT TGGAGTAATCCTCCTATTC225
ChickenCACATCGGACGAGGCCTATACTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGAAAC ATTGGAGTAATTTTATTATTT225
SalamanderCATATTGGTCGAGGAATATATTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGA AACATTGGAGTAATTTTATTATTT225
FishCACATTGGCCGAGGGTTATACTATGGCTCCTATTTATATAAAGAAACCTGAAATATT GGAGTTATCCTCCTCCTT225
圖3五種脊椎動物的細胞色素b的部分序列。如《實驗方法》一節所述用引物 L14841和Hl5149的擴增。氨基酸序列是人類mt
DNA的翻譯產物。其它序列分別是羊（綿羊，Ovisaries）、雞（原雞， Gullusgullus）、蠑螈（Ambystomatigrinum）和麗魚（Julidochromisregani）的。
用錯配引物進行的擴增
PRIMER
Fish5'-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3'
TEMPLATE
Human..................c..............
Cow...........A.........T.....T.....
Mouse............T.......T..........