PCR擴增產物的克隆——TA克隆法

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。

T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5'磷酸基和3'羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底，可對載體進行5'除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3'OH末端與5'端，所以除磷后載體不會自環。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5'端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自環造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環，能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。

外源DNA片斷

pMD 18-T VectorLigation bufferT4 ligateaserATP

超凈工作臺離心機恒溫搖床恒溫培養箱培養皿試管離心管電泳儀電泳槽凝膠樣品梳移液器

一、大腸桿菌感受態細胞的制備

1.  取大腸桿菌JM109保存液50 ul，接種于4 ml LB（或SOB）液體培養基中，37℃，300 rpm振蕩培養過夜，第二天取50 ul 轉接到新的4 ml LB（或SOB）液體培養基中擴大培養3 h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1 ml菌液于1.5 ml離心管中，冰浴10 min。

2.   4℃，5 000 rpm離心2 min，去上清液。

3.  加入750 ul預冷的0.1 M CaCl₂重懸菌體，冰浴30 min。

4.   4℃，5 000 rpm離心2 min，棄上清液。

5.  加入100 ul 冰冷的0.1 M CaCl₂輕輕重懸菌體，冰浴2 h后，4℃保存備用。

二、重組DNA的轉化

1.  將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預熱。

2.   于100 ul感受態細胞中加入10 ul連接產物，冰浴30 min。

3.  將離心管轉入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2 min。

4.  在離心管中加入SOC培養基300 ul，槍頭混勻，37℃、150 rpm溫和搖振60 min。

5.  將200 ul 轉化菌液均勻地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養過夜，挑選白色菌落進行鑒定。

三、重組質粒的鑒定

方案一： 菌落PCR

（1） 制備PCR混合液。

（2） 用經滅菌的10 ul 槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。

（3） 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。

（4） 將步驟 ⑶ 的樣品冷卻至室溫，離心數秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。

（5） 按以下條件進行PCR反應：94℃預變性3 min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94℃變性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環結束后72℃再延伸5 min。

（6） 取5 ul PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

方案二： 質粒PCR

1.  堿裂解法少量制備質粒DNA

（1）用離心管收集4 ml在LB培養基（含Amp）中培養過夜的菌液，14 000 rpm離心30秒，棄盡上清。

（2）用250 ul 已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細菌沉淀。

（3）加入250 ul Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉混合4-6次，此步驟不宜超過5 min。*Buffer S2使用后應立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO₂中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

（4）加入400 ul Buffer S3，溫和地上下翻轉8-10次，室溫靜置2 min，14 000 rpm離心10 min。

*若離心后凝結塊未沉淀到離心管底部，應再上下翻轉數次，12000g離心3min。

（5）將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5 500 rpm離心1 min。

（6） 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入500 ul Buffer W1，5500 rpm離心1 min。

（7）棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，加入700 ul 已加無水乙醇的Buffer W2，5 500 rpm離心1 min，以同樣的方法再用700 ul已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。

（8） 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中，14 000 rpm離心1 min。

（9）連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 離心管中，在silica 膜中央加入25-30 ul Eluent或去離子水。

（10）室溫靜置2 min，14 000 rpm離心1 min洗脫DNA。

（11） 取5 uL樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉化子。

2.  抽提純化質粒DNA酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質粒DNA中殘留的蛋白質。

（1） 加TE稀釋質粒DNA溶液至300 uL。

（2）加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3 min。

（3）14 000 rpm 離心5 min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3 min。

（4） 14 000 rpm離心5 min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3 min。

（5） 14 000rpm離心5 min，吸上清液，加2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后-20℃放置15 min，沉淀質粒DNA。

（6） 14 000rpm離心13 min，棄上清液，沉淀加入200 uL 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20 uL去離子雙蒸水溶解質粒DNA沉淀，-20℃保存待用。

（7） 取5 ul樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。

3.  質粒PCR

（1） PCR反應體系如下：

（2）PCR 擴增反應條件：94℃預變性3 min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：

94℃變性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循環結束后72℃再延伸5 min。

（3） 取5 ul PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，方法與試驗二相同。

1.  要獲得目的基因的TA克隆 ，PCR 產物的特異性要好。

2.  PCR 產物在TA克隆 前要通過純化。

3.  在PCR 產物回收、純化過程中防止外來DNA污染。

4.   制備感受態細胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態細胞受雜菌污染。

5.  42℃熱處理時很關鍵，轉移速度要快，且溫度要準確。

6.   菌液涂皿操作時，應避免反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉化率。

8.  Ligation Solution I 請于冰中融解。

9.  在進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2 ~ 10。在本制品中， pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩爾數約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩爾數約為0.15 pmol。

10.  克隆時使用的Insert DNA片段 (PCR 產物) 盡量進行切膠回收純化，PCR產物中的短片段DNA(甚至是電泳也無法確認的非特異性小片段)、殘存引物等雜質都會影響TA克隆的效率。

11.  按照本實驗操作進行連接后，直接進行轉化時的連接液不要超過20 ml。當進行轉化的DNA用量較大或準備進行電轉化時，需對連接液進行乙醇沉淀，純化DNA后再進行轉化。

12.   連接反應請在16℃下進行，溫度升高 (>26℃) 較難形成環狀DNA。

13.   連接效率偏低時，可適當延長連接時間至數小時。

14.   感受態細胞可使用適合于pUC系列載體的感受態細胞，如：JM109，DH5a等。

一、常見問題

1.  怎樣提高pMD18-T Vector的克隆效率?

（1） 純化PCR產物，切膠回收的PCR片段最好。

（2）除去殘存的引物等雜質。

（3）DNA片段的立體結構、DNA片段的長短都會影響克隆效率。一般情況下，大片段DNA的克隆效率（連接效率與轉化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的連接液進行轉化時，建議采用電轉化方法。

2.  PCR產物難以插入載體，為什么?

（1）確認PCR反應使用的DNA聚合酶在PCR產物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶擴增的PCR產物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等擴增得到的PCR產物不能直接用于TA克隆；PCR產物保存時間不要過長，長時間保存的PCR產物會脫去末端的"A"堿基。

（2）PCR產物中短片段雜質DNA太多，這時應切膠回收純化DNA片段，回收時PCR產物不要在紫外線下暴露時間過長。

（3）確認感受態細胞的轉化效率，使用的感受態細胞的轉化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

（4）確認Ligation Solution I 的連接效率是否降低，多次反復凍融會降低的Ligation Solution I 連接效率。

（5）確認抗生素的濃度是否過大。

（6）最好使用新配制的平板培養基。

3.  轉化后的菌落全為藍色 (或淡藍色)，為什么?

插入的PCR片段較短（小于500 bp)，且插入片段沒有影響lacZ基因的讀框時，平板培養基上出現的菌落有可能呈現藍色。

4.  插入的PCR產物進行測序時，可使用何種引物?

本制品的載體來源于pUC18載體。因此，用于pUC18載體測序的引物都可以使用。