PCR快速檢測技術及其在食品中的應用

　　 [摘 要] 微生物食品安全是當前消費者與食品工業共同關注的話題,食品中致病菌的快速、準確、簡便檢測,對于食品安全質量控制以及食品鏈中致病性細菌的溯源追蹤具有重要作用。在選用微生物的快速檢測方法時，應該考慮到方法的預期目標的精確性、檢測時間、經濟性、可接受性、操作簡便性、技術服務等因素。介紹了PCR檢測技術的概況,分析了PCR技術的原理及在食品檢測中的應用，進一步說明了這種技術在食品微生物檢測中的發展和應用。 
　　前言 
　　食品是人類賴以生存和發展的物質基礎，而食品營養、安全問題是關系到人體健康和國計民生的重大問題，特別是近年來發生的一些食源性疾病和食品安全問題，已經引起了人們的高度重視[1]。因此,食品中致病菌的快速、準確、簡便檢測,對于食品安全質量控制以及食品鏈中致病性細菌的溯源追蹤具有重要作用[2]。 
　　盡管食品微生物的檢測方法有很多種,但傳統的檢測方法費時、操作復雜，因此，針對食品中的致病和致腐微生物的快速檢測方法已成為國內外學者的研究熱點[3]。聚合酶鏈反應技術（PCR）方法應用于微生物檢驗，具有快速、特異性強、靈敏度高等突出優點[4]，因此越來越得到學術界的重視。 
　　1 聚合酶鏈反應技術(PCR)概況 
　　PCR(PolymeraseChainReaetion)即聚合酶鏈式反應，一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，也稱無細胞克隆系統。該方法可使極微量的目的基因或特定的DNA序列在短短幾個小時內擴增至百萬倍[5]。PCR技術是1983年由Millus和Cetus利用DNA變性與復性原理，針對目的基因設計一對特異寡核苷酸為引物的DNA小片段和4種脫氧核苷三磷酸dNTP，DNA聚合酶，以目的基因為模板進行的DNA體外精確擴增技術.由于反應進行多次循環，所以在短時間內擴增獲得大量目的基因[6].PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進來檢驗和純化，進行克隆、轉化和測序.此項技術具有操作簡便、靈敏度高、特異性強等特點。在該技術的應用中，大部分研究集中在微生物的生態分布和其他一些真菌上面，也有報道在肉中微生物檢測的應用[7]，相信該技術的成熟應用必將為食品學研究帶來變革。 
　　2 PCR技術的基本原理[8、9] 
　　PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性―退火―延伸三個基本反應步驟構成: 
　　(1)模板DNA的變性 模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備; 
　　(2)模板DNA與引物的退火(復性) 模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合; 
　　(3)引物的延伸 DNA模板―引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。這就完成了一個PCR循環，新合成的鏈都可作為下一次反應的模板，因此擴增產物的量是以指數級方式增加。 
　　3 PCR技術在食品中的應用 
　　從食品基質中直接提取DNA作為模板進行PCR分析，由圖譜了解食品中微生物的情況，作為食品的一項特性，與理化、感官特性一樣，可以用于分析, 這種方法可作為食品生物特性的鑒定和食品質量控制的有效工具。PCR還可用于檢測礦泉水的衛生質量。研究表明地下水和礦泉水具有不同的指紋圖譜，且樣品中還存在不可培養的微生物。含特定微生物種群的食品，其PCR圖譜非常簡單，每條帶都與預期的菌的條帶相對應[10]。如酸奶、含益生菌的飲料或基質, 可以用來鑒定產品中的益生菌含量與標簽上所標明的內容是否一致。 
　　3.1 PCR技術在水產品檢測中的應用 
　　近幾年，我國水產養殖業發展迅速，淡水養殖、海水養殖成為新一輪的投資熱點。因此PCR技術在水產養殖動物疾病診斷上的應用，對水產經濟動物的健康養殖具有重要的意義。Lin[11]對從馬拉巴石斑魚(E.malabaricus)和紫石斑魚(E.laneeolatus)分離的NNV編碼衣殼蛋白的RNAZ基因進行了克隆和測序。 
　　3.2 PCR技術在飲用水中致病性微生物的應用 
　　飲用水中的致病性微生物包括病毒、細菌、原生動物、蠕蟲等4類.大部分為腸源性，由糞便污染環境，再通過消化道進入新的宿主.由于人類以及動物糞便污染是水中病原體侵入機體的主要途徑，所以說污水是威脅健康的主要渠道.各項研究表明，PCR 技術從分子水平上分析微生物的種群特征，能夠迅速、準確水樣中微生物的分類、鑒定和種群動態分析[6]。 
　　3.3 PCR技術在食源性病原微生物檢測中的應用 
　　PCR技術具有敏感、專一等特點,不僅可以對病原微生物進行特異性識別,而且可以鑒別同一種類病原微生物的致病性菌株和非致病性菌株,因此應用PCR技術進行病原微生物的檢測具有十分獨特的優勢[12]。PCR技術在食品微生物中的應用也愈來愈廣泛,部分常見食源性病原微生物的PCR檢測已有相應的商品試劑盒出售。 
　　3.4 PCR技術在沙門氏菌檢測中的應用 
　　沙門氏菌能造成全身感染、食品中毒以及非常重要的動物性傳播疾病。近年來，用PCR技術檢測沙門氏菌得到了迅速發展。用PCR技術對各種不同血清型的沙門菌和已知被該菌污染的魚粉和動物產品的肉湯養物進行檢測，結果顯示該方法特異性高，且靈敏、快速，可檢出0.05pg水平的DNA，并可在1天之內完成[13]。 
　　4 結論 
　　PCR在食品微生物中的應用前景很大。當前，用于食品微生物檢測的方法耗時、昂貴，而且結果也不是那么準確，但采用分子生物學方法便可快速的得到可靠的結果。PCR可快速監測食品成熟階段中微生物的情況，評價產品中微生物的群落。總之,PCR技術的應用提高了環境微生物檢測技術的局限性及檢測速度,克服了傳統培養法的種種缺陷,隨著PCR技術的進一步發展和完善,其必將會得到更加普遍的推廣和發揮更大的效用。 
　　參 考 文 獻 
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