PCR產物的T載體克隆

（一）重組T質粒的構建
一．原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的 DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且 T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性，即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物；然后，酶-ATP復合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產生一個新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點，所以切割時出現兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對于單酶切來說，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進行，這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底，可對載體進行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會自環。一旦有外源片斷插入時，由外源片斷提供5’端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自
環造成的高本底。對于雙酶切來說，無論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環，能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在 37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。
二．材料與方法
1 材料
外源DNA片斷
2 儀器、用具
移液槍、碎冰
3 試劑
pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP
4 方法
連接體系如下：
16℃ 連接過夜。
（二） 重組質粒的轉化及陽性克隆的鑒定
1 材料
E.coli JM109菌株
2 儀器、用具
超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、恒溫培養箱、培養皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器
3 試劑
(1) CaCl2、LB平板（見附錄）；SOC培養基（見附錄）；SOB培養基
(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無水乙醇的Buffer W2a
(3) 1×電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6×加樣緩沖液
(4) 酚；氯仿；異戊醇
(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶
4 方法
1. 大腸桿菌感受態細胞的制備
(1) 取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4ml LB（或SOB）液體培養基中，37℃，300rpm振蕩培養過夜，第二天取50μl 轉接到新的4ml LB（或SOB）液體培養基中擴大培養3h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。
(2) 4℃，5000rpm離心2min，去上清液。
(3) 加入750μl預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。
(4) 4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。
(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存備用。
2. 重組DNA的轉化
(1) 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預熱。
(2) 于100μl感受態細胞中加入10μl連接產物，冰浴30min。
(3) 將離心管轉入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2min。
(4) 在離心管中加入SOC培養基300μl，槍頭混勻，37℃、150rpm溫和搖振60min。
(5) 將200μl 轉化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB平板上，37℃倒置培養過夜，挑選白色菌落進行鑒定。
注意事項：
① 制備感受態細胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態細胞受雜菌污染。
② 42℃熱處理時很關鍵，轉移速度要快，且溫度要準確。
③ 菌液涂皿操作時，應避免反復來回涂布，因為感受態細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉化率。
3． 重組質粒的鑒定
方案一 菌落PCR
(1) 制備PCR混合液：
(2) 用經滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
(3) 蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10 min。
(4) 將步驟 ⑶ 的樣品冷卻至室溫，離心數秒，然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。
(5) 按以下條件進行PCR反應：94℃預變性3min；然后進行30個循環反應，其溫度循環條件為：94℃變性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。
(6) 取5μl PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
方案二 質粒PCR
1. 堿裂解法少量制備質粒DNA
(1) 用離心管收集4ml在LB培養基（含Amp）中培養過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。
(2) 用250μl已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細菌沉淀。
(3) 加入250μl Buffer S2，溫和但充分地上下翻轉混合4-6次，此步驟不宜超過5min。
*Buffer S2使用后應立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH，降低溶菌效率。

(4) 加入400μl Buffer S3，溫和地上下翻轉8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。
*若離心后凝結塊未沉淀到離心管底部，應再上下翻轉數次，12000g離心3min。
(5) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。
(6) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm離心1min。
(7) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入700μl已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的Buffer
W2洗滌一次。
(8) 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。
(9) 連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中，在silica 膜
中央加入25-30μl Eluent或去離子水。
(10) 室溫靜置2 min，14000rpm離心1min洗脫DNA。
(11) 取5μL樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳初步篩選重組轉化子。
2. 抽提純化質粒DNA酚、氯仿抽提可以去除堿裂解法制備的質粒DNA中殘留的蛋白質。
(1) 加TE稀釋質粒DNA溶液至300μL。
(2) 加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），震蕩混勻，靜置3min。
(3) 14000rpm 離心5min，吸上清液，加等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），混勻，靜置3min。
(4) 14000rpm離心5min，吸上清液，加等體積的氯仿:異戊醇（24:1），混勻，靜置3min。

(5) 14000rpm離心5min，吸上清液，加2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻后-20℃放置15min，沉淀質粒DNA。
(6) 14000rpm離心13min，棄上清液，沉淀加入200μL 70%乙醇洗滌一次，室溫干燥，用20μL去離子雙蒸水溶解質粒DNA沉淀，-20℃保存待用。
(7) 取5μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。
3. 質粒PCR
(1) PCR反應體系如下：

(2) PCR 擴增反應條件：94℃預變性3min；然后進行30 個循環反應，其溫度循環條件為：
94℃變性1min，57℃退火1min，72 ℃延伸1min；循環結束后72℃再延伸5min。
(3) 取5μl PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，方法與試驗二相同。