PCR產物的直接純化

實驗概要

本實驗介紹了PCR產物直接純化的原理及操作步驟。

實驗原理

PCR產物一般都含有過量的引物、Taq   DNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程，因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多，商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。本實驗中，Buffer  PCR-A促使大于100bp的DNA片斷選擇性地吸附到silica膜上。經Buffer W1、Buffer  W2洗滌去除殘留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、單核苷酸、熒光染料或放射性同位素標記的單核苷酸后，吸附到silica膜上的  DNA片斷經微量水或Eluent洗脫下來，即可用于各種分子生物學的操作。

主要試劑

1. Buffer PCR-A

2. Buffer W1

3. 已加無水乙醇的Buffer W2

4. Eluent或去離子水

主要設備

1. 恒溫孵育器（65℃）

2.離心機

3. 移液器

4. 1.5ml 離心管

實驗材料

PCR產物

實驗步驟

1. 在PCR反應液中加入3倍體積的Buffer PCR-A，若需加入的Buffer PCR-A不足100μl，則加入100μl。
2. 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中，將步驟1中的混合液移入DNA-prep Tube中，5500rpm離心1min。
3. 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，加入500μl Buffer W1，5500rpm離心1min。
4. 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中，加入700μl 已加無水乙醇的Buffer W2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。
5. 棄濾液，將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中，14000rpm離心1min。
6. 連濾液一并棄掉收集管，將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中，在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去離子水（65℃預熱）。
7. 室溫靜置2min，14000rpm離心1min洗脫DNA。
8. 取5μl樣品，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。

注意事項

洗脫液預熱后可增大洗脫的DNA量，同時重復洗脫也可增加溶解的DNA量。