一.原理
PCR產物一般都含有過量的引物、Taq DNA酶及dNTP,這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用化試劑盒的出現使得DNA的純化過程變得更加簡便快捷。本實驗中,Buffer PCR-A促使大于100bp的DNA片斷選擇性地吸附到silica膜上。經Buffer W1、Buffer W2洗滌去除殘留在silica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、單核苷酸、熒光染料或放射性同位素標記的單核苷酸后,吸附到silica膜上的 DNA片斷經微量水或Eluent洗脫下來,即可用于各種分子生物學的操作。
二.材料與方法
1 材料
PCR產物
2 儀器、用具
恒溫孵育器(65℃)、離心機、移液器、1.5ml 離心管
3 試劑
Buffer PCR-A;Buffer W1;已加無水乙醇的Buffer W2;Eluent或去離子水
4 方法
(1) 在PCR反應液中加入3倍體積的Buffer PCR-A,若需加入的Buffer PCR-A不足100μl,則加入100μl。
(2) 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,將步驟⑴中的混合液移入DNA-prep Tube中,5500rpm離心1min。
(3) 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,加入500μl Buffer W1,5500rpm離心1min。
(4) 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube 中,加入700μl 已加無水乙醇的Buffer W2,5500rpm離心1min,以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的BufferW2洗滌一次。
(5) 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,14000rpm離心1min。
(6) 連濾液一并棄掉收集管,將DNA-prep Tube 置于一新的1.5ml 離心管中,在silica 膜中央加入25-30μl Eluent或去離子水(65℃預熱)。
(7) 室溫靜置2min,14000rpm離心1min洗脫DNA。
(8) 取5μl樣品,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化結果。