常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 與 Schwartz (1992) 發現在連接反應的溫育過程中，當反應液中存在過量的限制性內切核酸酶能顯著地增加重組質粒的產率。這種內切核酸酶的作用在于切割環狀的和線性的串聯體，而 這種內部的酶切位點是由質粒分子自連產生的。這種方法要求靶 DNA 分子與載體的連接消除其限制性酶切位點。在這個過程中還必須防止內切酶消化連接反應產生的重組子。在連接反應中，單位長度的線性載體分子不斷產生（或再 生）的凈效應將驅使連接反應的平衡態向有利于載體與插入片段連接產生重組子的方向進展。
實驗材料 噬菌體 T4 DNA 連接酶噬菌體 T4 DNA 聚合酶限制性內切核酸酶閉環質粒 DNA靶基因 DNA
試劑、試劑盒 ATPdNTP 溶液KGB 廣域緩沖液
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠水浴箱
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
10 mmol/L ATP
2 mmol/L dNTP 溶液（含四種 dNTP）
10X KGB 廣域緩沖液（1 mol/L 乙酸鉀，250 mmol/L Tris-acetate ( pH 7.6 )，100 mmol/L MgAc ( 含四水化合物），5 mmol/L β-巰基乙醇，100 μg/ml 牛血清白蛋白）
2. 酶與緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
噬菌體 T4 DNA 聚合酶
用于克隆的限制性內切核酸酶
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠
4. 核酸與寡核苷酸
閉環質粒 DNA ( 50 μg/ml）
靶基因 DNA ( 25 μg/ml) 及 PCR 擴增產物
5. 特殊設備
水浴箱預設水溫在 22℃
二、方法
1. 在一只微量離心管內，依次加入下列試劑，混勻：
50 μg/ml 閉環質粒載體 1 μl
25 μg/ml PCR 擴增靶 DNA 8 μl
10X KGB 廣域緩沖液 2 μl
H2O( 見下面注釋） 5 μl
10 mmol/L ATP 1 μl
2 mmol/L dNTP 1 μl
限制性內切核酸酶 2 單位
T4 DNA 聚合酶 1 單位
T4 DNA 連接酶 3 單位
注意：用 H2O 調整終反應體積為 20 μl 反應體系。
設置對照反應管，加入以上除了 PCR 擴增靶 DNA 的所有試劑。
2. 將連接反應混合液離心管在 22℃ 水浴溫育 4 h。
3. 將上述兩支試管內的連接反應混合液樣品各取 5 μl，用 10 μl H2O 稀釋后，轉化具有抗生素抗性的感受態大腸桿菌受體菌。將這種轉化菌液涂布于含適當抗生素和 IPTG 與 X-gal 的培養基的平皿上。
4. 計算實驗管與對照管在培養皿上的菌落數。
挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色單菌落進行培養擴增，抽提質粒 DNA，利用質粒多克隆位點內的插入外源 DNA 片段側翼的酶切位點，用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑒定；也可以用菌落 PCR 予以鑒定。
5. 通過瓊脂糖凝膠電泳測定克隆 DNA 片段的大小（采用合適的 DNA marker 分子量作對照）。
6. 利用 DNA 序列分析、限制性內切核酸酶圖譜或 Southern 雜交進一步鑒定克隆的靶基因 DNA 片段的正確性。