Nature：CRISPR浪潮席卷學界

　　每當有新的CIRSPR-Cas9相關文章發表時，Addgene公司的工作人員就會迫不及待地研讀。Addgene是家非盈利公司，研究者們把自己使用的分子工具存放在這里，以供其他科學家們盡快使用這一技術。Addgene公司執行董事Joanne Kamens 指出，一篇大熱的論文一發表，幾分鐘內他們就會接到咨詢電話。

　　早在2013年，研究人員就首次報道了使用CRISPR-Cas9系統切除人類細胞中特定位點的基因的研究。此后，Addgene的電話就一直處于忙碌狀態。Kamens 表示，全體員工都忙著接電話。分子生物學家們迫不及待地想使用這個技術，因為這個技術能簡便精準地對各個生物的基因進行編輯。Addgene配送了60000 個CRISPR相關分子工具——占其配送試劑總量的17%，這些工具被送到 83個國家的研究人員手里。單單2015年一年，該公司CRISPR相關頁面瀏覽次數就超過一百萬次。

　　許多關于CRISPR-Cas9的討論都圍繞著其在治療疾病或編輯人類胚胎基因上的潛力。但研究人員指出，真正的革命發生在實驗室。CRISPR最突出的優點是特異性：在廣闊的基因組里靶向到目標位點。基因編輯只是CRISPR眾多用處中的一個。科學家們正在研究使用CRISPR系統將蛋白質精確地遞送到目標基因處，激活或抑制該基因。更宏偉的目標包括編輯整個生物網絡，實現理解細胞系統和疾病這一長期目標。

　　波士頓兒童醫院（Boston Children's Hospital）的血液學家Daniel Bauer表示，對于分子生物學家，CRISPR是強有力的研究基因組的工具。而南加利福利亞大學（University of Southern California）的分子生物學家Peggy Farnham補充，CRISPR能有助于解答很多以前無法解答的問題。

　　破碎的剪刀

　　CRISPR-Cas9系統有兩個主要成分：剪切DNA分子的雙分子剪刀Cas9酶，和一個小的、把剪刀靶向到特定DNA序列的RNA分子。細胞的固有DNA修復機制一般會修復斷裂處，但往往會出錯。

　　對于那些想要通過基因沉默來研究基因功能的研究者來說，這是個福音。遺傳毫無人情可言：修復過程中引入的一個小錯誤可以完全改變其編碼的蛋白質，或者完全停止該蛋白的合成。因此，科學家可以研究，當一個基因被沉默時細胞或生物體會發生哪些事情。

　　但也有不同的修復途徑，即根據DNA模板修復斷裂處。這就意味著，如果研究人員提供模板，那么他們可以在任意位點插入或刪除任意序列。

　　2012年，各個實驗室投入到證明基因編輯在人類DNA上的可行性的競賽中時，一個團隊采取了截然不同的做法。“我們做的第一件事是我們把剪刀打碎。”加利福利亞大學（University of California）的系統生物學家Jonathan Weissman這樣說道。

　　Weissman從斯坦福大學（Stanford University）的合成生物學家Stanley Qi那里學到這一技術。Qi突變了Cas9酶，突變后，Cas9依然與向導RNA靶向的DNA序列結合，但并不切割該序列。相反，Cas9停留在該處，阻斷該DNA轉錄成RNA。這樣一來，不用改變DNA序列，就能夠沉默基因。

　　然后Weissman等人利用這種突變的Cas9做了一些新的嘗試，例如，將其與另一種能激活DNA轉錄的蛋白質結合在一起。利用這些技術，他們能隨意控制基因的“開”和“關”。

　　幾個實驗室都在這種方法的基礎上建立了一些新方法，更多的實驗室迫不及待地在自己的研究中使用CRISPR。一種流行的做法是快速產生幾百種不同的細胞株，每個CRISPR系統包含一個不同的向導RNA分子，靶向不同的基因。另一名加利福利亞大學的系統生物學家Martin Kampmann希望篩選這些細胞株，看看打開或關閉特定基因是否會影響暴露于毒性蛋白聚集體下的神經元——幾種神經退行性疾病的發病機制之一——的存活。

　　Kampmann之前使用小干擾RNA（一種沉默基因的技術，可以同時處理多個分子）來完成這樣的篩選。但小干擾RNA技術有缺點——脫靶效應顯著。相比而言，CRISPR的特異性更高。

　　Weissman等人，包括加州大學的系統生物學家Wendell Lim，進一步優化了CRISPR系統，延長了導向RNA的長度，增加了能與不同蛋白結合的基序。這樣，在同一個實驗里，可以同時激活或抑制三個不同的位點。Lim認為，這個系統能同時處理多達五個位點。

　　他表示，位點數目的限制主要在于能進入細胞的向導RNA長度和蛋白大小。其實還是有效載荷的問題。

　　麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology）合成生物學家Ron Weiss也投身到了CRISPR的狂潮中。Weiss等人也在單個實驗里，實現了多個基因調控，從而更快、更容易地建立復雜的生物通路，例如，把細胞的代謝機制轉化為生物能源工廠。Weiss指出，合成生物學最重要的目標是通過創造這些復雜的通路，構建復雜的行為。

　　CIRSPR表觀遺傳學

　　當遺傳學家Marianne Rots開始職業生涯時，她想發現新的醫療方法。她研究了以基因突變為靶點的基因療法。但幾年后，她決定改變策略。現工作于荷蘭格羅寧根大學醫學中心（University Medical Center Groningen）的Rots認為，很多疾病是受多個基因突變影響的，單基因遺傳病非常少。最好的方法是控制基因的活力，調控表觀組學，而非單單關注基因本身。

　　表觀基因是指添加到DNA或組蛋白上的一些化學化合物。這些化合物能調控基因的表達。隨著時間的推移，這些遺傳標志也會發生變化：隨著個體的發展及環境變化，它們會被添加或刪除。

　　在過去的幾年中，數以百萬計的美元流入了編寫人類細胞表觀遺傳標記目錄的項目中。人們發現，這些表觀遺傳標記與各種生理活動緊密相關，例如腦活動和腫瘤生長。但是過去科學家們沒有改變特定位點表觀遺傳標記的工具，所以無法確定表觀遺傳標記的變化是否會導致生物變化。阿拉巴馬大學（University of Alabama）伯明翰分校的神經學家Jeremy Day指出，這個領域由于缺乏適當的工具，直接研究基因的功能和表觀遺傳標記的功能，因此一直遭遇諸多阻力。

　　CRISPR-Cas9扭轉了這一局面。2015年4月，北卡羅來納州杜克大學（Duke University）的生物工程學家Charles Gersbach等人發表論文，報道了一種使用失活的Cas9為基因組特定位點的組蛋白添加乙酰基——一種表觀遺傳標記——的系統。

　　研究小組發現，與DNA纏繞的組蛋白被乙酰化后，足以大幅度增加靶基因的表達水平。這證實了該系統的有效性，以及在這個位點，表觀遺傳標記有激活基因表達的功能。論文發表后，Gersbach把酶存儲到了Addgene公司，供其他研究小組使用——確實有很多小組很快就使用Gersbach的這一技術。Gersbach預言，一大波證明同時操控多個表觀遺傳標記能產生協同作用的論文正要來襲。

　　但這些工具仍需改進。幾十種酶可以添加或刪除一個表觀遺傳標記，但并不是所有的酶都適合融入失活的CRISPR系統。Gersbach表示，這比很多人預想的要難得多，很多分子與Cas9耦合后，根本不發生作用。可能的原因非常多，例如可能是研究方法沒有發揮作用，也可能是表觀遺傳標記在特定的細胞或環境里不起作用。但具體是哪個原因非常難以確定。

　　Rots之前使用舊的基因編輯工具鋅指蛋白來研究癌癥相關表觀遺傳標記的功能，現在她開始改用CRISPR-Cas9。她指出，CRISPR-Cas9已經席卷了整個領域，并已經產生了廣泛的影響。人們常說，相關性是巧合——因為你改變了表觀遺傳，但它對基因表達沒有影響。 但現在測試表觀遺傳標記對基因表達的作用非常簡單，很多人都加入到這個領域中了。

　　CRISPR代碼破解

　　DNA上的表觀遺傳標記并不是唯一有待解析的基因組密碼。超過98%的人類基因組不編碼蛋白質。但是研究人員認為，很多非編碼DNA也有重要作用。他們正采用CRISPR-Cas9來探索這一謎題。

　　一些DNA編碼，如miRNA和長鏈非編碼RNA等RNA分子。人們認為，這些RNA分子具有除開制造蛋白質以外的功能。一些序列是按需增強基因表達的增強子。大部分與常見疾病風險相關的DNA序列位于非編碼RNA和增強子區域。但在CRISPR-Cas9問世之前，科學家們很難研究這些序列的具體作用機制。Bauer指出，過去很難解析這些序列的功能，但現在的實驗更精細。

　　Farnham等人利用CRISPR-Cas9刪除與前列腺癌和結腸癌相關的增強子區域的突變。結果有時讓她感到驚訝。在一項未發表的實驗中，她的團隊刪除了一個被認為很重要的增強子，但與它相鄰的一百萬個堿基中沒有基因發生了表達上的變化。她表示她們會對一個調控元件的影響力進行分類，但很多時候刪除它，你會發現和原來的分類不符。

　　研究人員利用CRISPR-Cas9研究大片調控DNA時，會得到更多驚喜結果。由麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology）遺傳學家David Gifford、楊百翰大學（Brigham Young University）遺傳學家Richard Sherwood以及波士頓婦女醫院（Women's Hospital in Boston）領頭的小組使用CRISPR-Cas9技術對40000個堿基的序列引入突變，然后檢查是否每個突變會對附近的、能產生熒光蛋白的基因的活力產生影響。這個項目最后得到一幅增強基因表達的DNA序列圖，其中包括一些基于基因調控特征，如染色質修飾無法預測到的序列。

　　即使使用CRISPR-Cas9，也難以深入研究這些非編碼DNA序列。Cas9酶在向導RNA的引導下，切割序列。但要求是該序列旁邊存在一個常見卻特異的DNA序列。這對于想要沉默基因的研究者來說不成問題，因為這種重要的序列基本都存在于目標基因內的某處。但是對于那些想對短的、非編碼RNA序列進行特異性修飾的研究者來說，可選擇的RNA配對序列非常有限。荷蘭癌癥研究所（Netherlands Cancer Institute）的研究人員Reuven Agami表示，并不是所有序列都適合作為靶向序列。

　　研究人員在細菌王國里尋找Cas9的近親，希望能找到識別不同序列的DNA切割酶。去年，哈佛-麻省理工學院博德研究所的張鋒團隊發現了Cpf1家族，與Cas9有類似的工作機制，能擴大序列的選擇范圍。但Agmai指出，目前沒有一種替代酶比Cas9有效。在未來，他希望有完整的DNA切割酶工具盒，可以靶向基因組的任意位點。但目前還未實現這一目標。

　　當CRISPR邂逅光

　　Gersbach的實驗室使用基因編輯工具，以了解細胞命運和如何調控細胞命運。他們希望有一天能在培養皿里培養藥物篩選和細胞治療使用的組織。但CRISPR-Cas9的效果是永久性的，而Gersbach的團隊需要瞬時打開和關閉組織特定位置的基因。他指出，形成血管都需要非常精密的控制，更復雜的生理過程對基因調控的要求更高。

　　Gersbach等人把失活的Cas9與基因激活分子、藍光可激活的蛋白耦合起來。由此產生了一個光照時能激活基因表達，停止照射時，基因表達停止的基因操控系統。東京大學（University of Tokyo）的化學生物學家Moritoshi Sato也構建了一個類似的體系。該體系使用活性的Cas9，僅在藍光照射下，Cas9才會切割DNA。

　　其他試驗也通過把CRISPR與化學開關結合得到了各種不同的基因編輯系統。紐約威爾康奈爾醫學院（Weill Cornell Medical College）的癌癥遺傳學家Lukas Dow，希望對成年大樹癌癥相關基因進行突變——復制一個與人類大腸癌相關的基因突變。他的團隊設計了一個CRISPR–Cas9系統：一定劑量的復方多西環素能激活Cas9體系，使其切割目標基因。

　　這些工具都是研究者們實現精細基因組編輯的探索。Gersbach的團隊尚未誘導血管生成，目前研究人員正致力于提高光控系統的效率。Gersbach表示，這只是第一代系統，后續還會不斷改良。

　　CRISPR模型

　　癌癥研究人員Wen Xue在他的博士后生涯里花費了數年培育出一種攜帶一種人類肝癌相關的突變的轉基因鼠。他亦步亦趨地開展實驗，學習基因編輯工具，將其注射到胚胎干細胞中，然后試圖獲得小鼠突變。為此，他一年花費了2萬美元。他指出，這是研究疾病基因的限速步驟。

　　幾年后，當他正要開始另一個轉基因小鼠實驗時，他的導師建議他使用CRISPR-Cas9工具。這一次，Xue訂購了CRISPR-Cas9試劑盒，將其注入小鼠胚胎中，幾周后就得到了想要的突變鼠。“我們一個月就得到了轉基因鼠，”Xue說，“我真希望我能早點使用這個技術，那樣我的博士后時間會大大縮短。”

　　從癌癥到神經退行性疾病等領域的研究者們都以極大的熱情，學習、使用CRISPR-Cas9來創造疾病動物模型。CRISPR系統縮短了轉基因動物模型建立的時間，增加了基因調控的精細程度，并擴大了可編輯的物種范圍。Xue現在在麻州大學醫學院（University of Massachusetts Medical School）成立了自己的實驗室，利用CRISPR-Cas9在細胞與動物突變模型上系統地篩選腫瘤基因組數據。

　　研究人員希望把多種新的CRISPR-Cas9技術融合起來，實現基因組和表觀組的精細操控。Dow指出，這些系統的整合威力不容小覷。這可能幫助科學家們捕捉和理解人類疾病的復雜性。

　　以腫瘤為例，一個腫瘤可以包含幾十個可能有助癌癥發展的突變。Dow指出，對于建模，可能不需要關注這么多突變。但是建立惡性程度高、接近人類癌癥真實情況的疾病模型，研究者可能需要在模型中引入2-4個突變。使用舊的基因編輯工具引入突變非常費時，而且成本極高。

　　2015年生物工程師Patrick Hsu 在加州薩克生物研究所（Salk Institute for Biological Studies）建立了自己的實驗室。他計劃利用基因編輯工具建立帕金森病和阿茲海默癥等神經退行性疾病的細胞和狨猴模型。相比于小鼠模型，狨猴模型能更有效地模擬人類行為和疾病發展。如果使用舊的基因編輯工具，建立狨猴模型成本極高，且進展緩慢。

　　雖然Hsu設計實驗，使用CRISPR-Cas9來編輯狨猴的基因，但他已經意識到，該工作可能只是下一步工作的墊腳石。他表示，技術會不斷更新換代。研究者不能死守舊方法，應當時常思考哪些生物問題需要解決。