Natureimmunoloy：新冠肺炎患者的單細胞免疫圖譜

　　研究人員應用單細胞測序技術全面揭示了輕中型、重型新冠肺炎患者及其從發病期到康復期機體整體免疫學變化特征、機制和規律。

　　 今年年初，新冠肺炎疫情在世界范圍內快速暴發。根據世界衛生組織最新統計數據顯示，截止到2020年8月11日，新冠肺炎在全球已導致累計近2000萬確診病例和超過73萬死亡病例，平均每天新增逾20萬確診病例和4000死亡病例[1]。新冠肺炎在有些國家仍呈大流行趨勢，尚未得到有效控制，目前針對新冠肺炎還沒有特效藥物和疫苗。因此，揭示疾病進程、闡明發病機制對臨床診治十分重要，尤其是對藥物和疫苗的研發尤為關鍵。

　　針對此科學問題，中國人民解放軍總醫院第五醫學中心王福生院士團隊與北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)、生命科學學院白凡研究員團隊開展合作研究，應用單細胞測序技術全面揭示了輕中型、重型新冠肺炎患者及其從發病期到康復期機體整體免疫學變化特征、機制和規律。研究論文"Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19"于2020年8月12日，在線發表于國際免疫學著名期刊Nature Immunology上。

　　在本項研究中，研究團隊通過對來自13名新冠肺炎感染者的17例（輕中型7例，重型4例和康復期6例）外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)樣本進行高通量單細胞測序(圖一)，結合單細胞轉錄組以及免疫組學數據，詳細描繪了新冠肺炎輕中型、重型和康復期患者的免疫反應圖譜。

圖一：研究流程示意圖與PBMC免疫圖譜細胞類型

　　首先，研究人員通過整合健康人和新冠肺炎患者的樣本，一共獲得了122542個高質量的單細胞數據。進一步聚類識別出14種主要的細胞類群，包括T、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和樹突狀細胞等(圖一)。通過與健康人對比，研究團隊在新冠肺炎患者PBMC中發現了與特異性免疫應答相關的細胞占比大幅度上升，如處于激活狀態和增殖狀態的T細胞以及漿細胞等；而處于未激活狀態下的T細胞(naive T)和單核細胞狀來源的樹突細胞(Mono DCs)等細胞相對健康人明顯下降，這提示新冠肺炎患者存在廣泛的免疫激活(圖二)。

　　盡管處于康復期的新冠肺炎患者的許多臨床指標恢復正常，但是像naive T等細胞類群并沒有恢復到健康人的比例。接著為了探究SARS-CoV-2病毒感染導致的患者抗病毒免疫響應情況，團隊在進一步研究中發現，在新冠肺炎患者PBMC中，包括天然免疫細胞和適應性免疫細胞等多種細胞類型均存在非常強烈的I型干擾素響應以及較強的急性炎癥反應。同時細胞凋亡和遷移能力也有所升高，并且這些現象在重型新冠肺炎患者中尤為明顯(圖二)。

圖二：PBMC各種細胞比例與細胞狀態比較

　　為了更加深入地探究適應性免疫細胞的免疫特點，研究人員對T、B細胞主群進行了進一步的分析和研究，揭示了T、B細胞亞群成分在健康人及新冠肺炎感染不同癥狀患者中的動態變化、克隆擴增特點等免疫反應特征。首先研究人員將55655個T淋巴細胞細分為12個細胞亞群(圖三)。發現相比于健康人，處于未激活狀態的細胞類群比例在新冠肺炎患者中明顯下降，例如CD4+ Naive, CD4+ Memory, CD4+Effector Memory, Treg, CD8+ Naive 和 NKT Naive 亞群。即使在康復期，CD4+ Naive, CD8+Naive 和Treg 細胞亞群仍沒有恢復到健康人的水平。

　　然而，新冠肺炎患者的激活狀態T細胞比例明顯增加，包括CD4+ Effector-GNLY, CD8+Effector-GNLY, NKT CD56 和 NKT CD160 細胞亞群。特別地，研究人員發現了一群在輕中型患者中顯著的富集的特異性表達CD160的NKT細胞，這群NKT細胞的轉錄組特征與之前報道的可以有效抗病毒的gd NKT /Vδ1 T細胞類似[2-5]，提示這群細胞可能與SARS-CoV-2感染的疾病嚴重程度相關。

　　通過對T細胞殺傷活性和耗竭狀態進行評估，研究人員發現在輕中型患者中效應T細胞表現出更強的細胞殺傷毒性和更低的耗竭狀態。然而在重型新冠肺炎患者中效應T細胞展現出更高的耗竭狀態(圖三)。

　　團隊通過整合T細胞轉錄組與免疫組TCR序列數據，發現相比健康人，新冠肺炎患者T細胞發生了明顯的克隆擴增，克隆擴增主要發生在效應T細胞亞群CD4+ Effector-GNLY, CD8+Effector-GZMK和CD8+ Effector-GNLY中。并且輕中型新冠肺炎患者相比重型展現出更明顯有效的克隆擴增(圖四)。以上結果提示，效應T細胞比例和活性的增加以及有效的克隆擴增等特點可能是輕中型新冠肺炎患者相比重型能更有效控制病毒的原因。

圖三：T細胞亞群比例變化與狀態比較

圖四：T細胞亞群克隆特征

　　針對B淋巴細胞，研究人員將11377個B淋巴細胞細分為6個細胞亞群(圖五)。相比健康人，新冠肺炎患者記憶B細胞亞群比例明顯低于健康人，而生發中心B細胞(Germinal Center B)、漿細胞(Plasma B)和處于增殖狀態下的漿細胞(Dividing Plasma B)亞群比例上升。特別是在重型患者中發現了更高比例的漿細胞和正在增殖的漿細胞。

　　在進一步整合B細胞轉錄組與免疫組BCR序列數據之后，研究團隊發現新冠肺炎重型患者的B淋巴細胞中存在IGHV和IGKJ等基因的使用偏好性和明顯克隆擴增現象。尤其是漿細胞擴增現象更為明顯(圖六)。以上結果提示體液免疫高度活化是重型患者的典型免疫響應特點。

圖五：B細胞亞群鑒定和比例變化

圖六：B細胞亞群克隆特征

　　該研究基于高通量單細胞轉錄組數據及配對的TCR/BCR序列數據，全面刻畫了在新冠肺炎感染不同癥狀患者中，先天性免疫細胞和T、B細胞亞群的動態變化、克隆特點等免疫反應特征。為進一步理解、控制和攻克新冠肺炎疫情提供了寶貴的數據參考和資源。

　　解放軍總醫院第五醫學中心王福生院士和北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)、生命科學學院白凡研究員為本文的共同通訊作者。解放軍總醫院第五醫學中心張紀元博士、徐哲博士，北京大學生物醫學前沿創新中心(BIOPIC)、生命科學學院博士研究生王湘銘和清華大學生命科學學院博士研究生邢旭東為本文的共同第一作者。

　　參考文獻

　　[1]https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports

　　[2]Pizzolato, G. et al. Single-cell RNA sequencingunveils the shared and the distinct cytotoxic hallmarks of human TCRVδ1 andTCRVδ2 γδ T lymphocytes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 11906–11915 (2019).

　　[3]Couzi, L. et al. Common features of γδ T cellsand CD8+ αβ T cells responding to human cytomegalovirus infection in kidneytransplant recipients. J. Infect. Dis. 200, 1415–1424 (2009).

　　[4]Déchanet, J. et al. Implication of γδ T cellsin the human immune response to cytomegalovirus. J. Clin. Invest. 103, 1437–1449(1999).

　　[5]Farnault, L. et al. Clinical evidenceimplicating γδ T cells in EBV control following cord blood transplantation.Bone Marrow Transpl. 48, 1478–1479 (2013)