NatureBiotechnology發布CRISPR基因編輯新成果

　　第一次研究人員利用一種病毒載體傳送基因組編輯元件來治療罹患一種遺傳疾病的動物模型，糾正了致病突變。賓夕法尼亞大學Perelman醫學院研究人員領導的一項新研究表明，將這一載體傳送到新生小鼠體內可改善它們的生存，但出人意料地是治療成年小鼠則會讓它們的情況變得更糟。該研究小組將他們的成果發布在本周的《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上。

　　論文的資深作者是Perelman醫學院醫學教授、罕見病中心主任James Wilson博士。去年8月，Nature Biotechnology雜志公布了2014年度轉化領域最頂尖的20名研究者的排名，Wilson博士因2014年獲批的ZL數量達到10個而位列其中。

　　Wilson博士說：“在出生后糾正這一動物模型中的一種致病突變讓我們朝著實現個體化醫療的潛能更進了一步。長達35年的基因治療研究生涯讓我知道將小鼠研究轉化為成功地人類治療有多么的困難。我們現正在調控這一基因編輯系統，以求在我們下一階段的調查研究中解決成年動物中看到的這些意料之外的并發癥。”

　　Wilson實驗室在由鳥胺酸氨甲酰基轉移酶（OTC）缺陷引起的一種罕見代謝性尿素循環障礙疾病(urea-cycle disorder)動物模型中展開了研究。OTC缺陷是最常見的尿素循環障礙疾病，在每4萬個新生兒中就有一人受累于這一疾病。突變OTC基因可編碼生成比正常要短，呈錯誤的形狀的酶 ，或有可能根本不生成蛋白。由于負責OTC缺陷的遺傳突變發生在X染色體上，因此婦女通常是攜帶者，她們攜帶突變基因的兒子會罹患這種疾病。

　　剪切和粘貼

　　研究小組將兩個腺相關病毒（AVV,具體來說是Wilson實驗室發現對肝細胞有親和力的AAV8血清型）注入到了有OTC缺陷的新生小鼠體內，一個AAV表達Cas9，另一個表達一條導向RNA和供體DNA。

　　傳送Cas9的AAV通過一種肝臟特異性的啟動子，確保了當AAV注入到血液中時它只在肝細胞中表達。這一雙系統中的另一個AAV傳送了一條導向RNA，并且這一AAV還包含了糾正突變的一個供體DNA模板使得細胞能夠生成正常的OTC蛋白。

　　整個校正系統從根本上說是發揮一種“剪切和粘貼”功能，最后的“粘貼”階段依賴于細胞自身的DNA修復機制來正確地重新連接OTC基因。

　　在新生小鼠中，注入的AAV系統在10%的肝細胞中糾正了突變，他們還看到在遭遇一種高蛋白飲食挑戰（在小鼠中這會使得OTC缺陷癥狀更加嚴重）的年輕小鼠中存活率增高了。相比之下，30%以上的未處理OTC缺陷小鼠在一周后死亡，它們的氨水平顯著高于基因獲得糾正的OTC小鼠。深度測序從治療小鼠肝細胞中分離出的DNA也表明，突變獲得糾正與生存結果相一致。

　　另一方面，使用相同的雙AAV系統在8-10周齡的成年OTC缺陷小鼠中基因校正率要低得多。這些成年小鼠還顯示在正常的普通飲食條件下蛋白質耐量降低及致命的高血氨癥 (hyperammonemia)。3周后，給予低劑量基因校正治療的成年小鼠開始死亡，違反直覺地是，給予高劑量基因校正治療的小鼠在注射后9天開始死亡。

　　論文的共同第一作者、病理學與實驗醫學研究副教授Lili Wang博士說：我們對這些結果感到驚訝，通過進一步的研究我們闡明了基因編輯加重成年動物病情的機制。通過檢測成年小鼠肝細胞中的DNA序列，他們發現具有校正粘貼功能的細胞的比率僅為1%。“這肯定不足以幫助這些成年小鼠，”Wang指出。更嚴重的問題及完全出乎意料地是，許多未校正基因包含大片段缺失，消除了突變OTC基因的殘余活性。

　　糾正基因的第一步就是在有供體DNA存在的情況下，通過Cas9在突變的附近造成DNA斷裂（切割），這為在所謂的同源介導修復（HDR）中糾正突變創造了條件。“看起來，相比于成體肝細胞，HDR在新生肝細胞中更有效，”Wilson說。

　　在缺乏HDR的情況下，細胞則會利用另一個稱作為非同源末端連接(NHEJ)的過程來修復切割。研究小組了解到，在成體肝細胞中NHEJ造成了更大的片段缺失，其中一些消除了OTC基因的殘存功能。

　　當前，這一研究小組正在探索一些方法在不引發大片段缺失的情況下進行切割，并同時提高粘貼的效率，力圖避免在罹患肝病的成年患者中出現上述問題。

　　去年3月，Whitehead研究所的研究人員曾提出了一個通過抑制NHEJ完善CRISPR/Cas系統的方案。他們在對受精卵進行基因編輯的同時使用了一種抗癌藥物Scr7，Scr7能結合DNA連接酶I進而阻斷NHEJ修復通路。他們的這項研究將CRISPR/Cas的效率提高了19倍。

　　另外，在今天的Nature Biotechnology雜志上，麻省理工學院的研究人員稱他們開發出了一種方法，能夠安全、高效地利用CRISPR治療疾病。