Nature重大進展！聯合企業，共同突破基因藥物遞送瓶頸！

　　最近，單鏈反義寡核苷酸（ASO）已被廣泛研究用于治療中樞神經系統疾病。SPINRAZA 被批準用于治療脊髓性肌萎縮癥，是一種單鏈 ASO，可調節 SMN2 前體 mRNA 的剪接。單鏈 ASO 在全身給藥后不進入 CNS，而是通過鞘內注射直接給藥到腦脊液中。SPINRAZA 的經驗表明，大多數個體對鞘內給藥的耐受性良好。然而，鞘內注射比靜脈內 (i.v.) 注射更具侵入性，對于患有嚴重腰椎側彎的個體或與抗凝治療聯合使用可能會很困難。因此，將 ASO 從血液輸送到大腦的有效方法將是有利的。

　　全身注射后用于調節中樞神經系統基因表達的寡核苷酸類藥物必須能夠跨越強大的血管屏障，包括血腦屏障和血液-腦脊液屏障。通常，只有分子量<450 Da的疏水小分子才能穿透這些屏障。最近的幾種將寡核苷酸導入中樞神經系統的策略沒有顯示出有效的RNA降解。之前報道了一種DNA/RNA異源雙鏈寡核苷酸(HDO)技術，該技術通過靜脈注射在小鼠和非人靈長類動物的肝臟中實現有效的RNA降解。然而，傳遞到大腦仍然是微不足道的。

　　鑒于此，東京醫科齒科大學Takanori Yokota聯合武田制藥公司、美國Ionis制藥公司的研究人員表明，在RNA鏈5′端與膽固醇或α-生育酚結合的DNA/RNA異源雙鏈寡核苷酸藥物可以通過靜脈或皮下給藥有效地穿過血腦屏障。成果發表在Nature Biotechnology上。

　　研究人員合成并評估了14種親脂質性結合物，包括9種天然脂肪酸和甾醇，用于小鼠中樞神經系統的基因敲除。將靶向非編碼RNA轉移相關肺腺癌1（Malat1）的全硫代磷酸酯（PS）修飾的鎖定核酸（LNA）/DNA gapmer與2'-O-甲基糖修飾的 RNA/RNA 互補鏈形成雙鏈與各種疏水部分結合。

　　在 50 mg kg-1 的劑量下，通過qRT-PCR測量大腦皮層中的 Malat1 RNA 水平。單鏈 ASO 沒有觀察到 Malat1 的敲低，這與之前的研究結果一致，即單鏈 ASO 在全身注射后確實滲透到 CNS 中。長鏈脂肪酸結合物，如月桂酰 (C12)、月桂酰 (C12OH)、硬脂酰 (C18) 和 α-生育酚，在 CNS 中表現出適度的 Malat1 抑制，但膽固醇結合物是最有效的，單次靜脈注射可將Malat1水平降低約60%。此外，與單鏈ASO結合物相比，加上HDO的設計也有助于向中樞神經系統傳遞。

　　研究人員還進行了一項劑量反應研究，兩種 Chol-HDO 在皮質和脊髓中都顯示出劑量依賴性的靶基因敲低。大腦皮層和脊髓中 RNA 表達的減少在第 7-14 天達到最大。Chol-HDO 的 RNA 減少在整個大腦中持續了 2 個月以上。

　　與其他治療方式相比，ASOs 的代謝穩定性在 CNS 中是長期存在的，這表明可以通過重復給藥來提高 ASOs 的組織濃度來改善寡核苷酸的遞送策略。即重復注射 Chol-HDO 會產生 RNA 減少效果的簡單總和。HDOs 分布在整個大腦、脊髓和外周組織中，并在 CNS 中抑制四種靶基因的表達高達 90%。在主要的中樞神經系統細胞類型中觀察到基因敲低，在神經元和小膠質細胞中最為明顯。

　　研究人員還比較了全身 Chol-HDO 遞送與單鏈 ASO 直接腦室內 (i.c.v.) 推注給藥的效率，這是目前鞘內給藥療法臨床前開發的策略。研究人員發現全身給藥的 Chol-HDO 和 i.c.v. 給藥的 ASO 的 EC50 值相似。將這些結果與 i.c.v. 給藥的 Chol-HDO 和 ASO 獲得的 ED50 值進行比較表明，直接 i.c.v. 注射需要較低的劑量才能在中樞神經系統中實現相同水平的敲低。這可以設想一種聯合策略，即使用鞘內注射快速達到中樞神經系統中ASO的治療濃度，然后對需要終身治療的個體進行靜脈注射或皮下注射Chol HDO的維持治療。

　　在治療主要局限于中樞神經系統的疾病時，該技術的一個潛在安全性問題是，Chol HDO的生物分布在外周組織中遠遠大于在大腦中，從而導致潛在的不良副作用。然而，盡管用Chol-HDO觀察CNS靶基因敲除所需的劑量較高，而且即使在外周器官（如肝臟和腎臟）中觀察到ASO相對于CNS有較高的積累，但該化合物通常具有良好的耐受性。這種在外周器官中的分布特征是未結合和脂質結合的 ASO 和短干擾 RNA (siRNA) 的典型特征。

　　綜上所述，膽固醇 HDO 設計在抑制 CNS 中的基因表達方面最有效。相比之下，Chol-ASO 和 Chol-siRNA 在全身給藥后在 CNS 中不顯示活性。這表明 ASO 從血液輸送到 CNS 需要膽固醇和特定的雙鏈寡核苷酸結構的組合。事實上，具有環狀結構框架的膽固醇和生育酚都比直鏈脂肪酸更有效，這表明特定脂質結構的優勢。

　　參考文獻：

　　Nagata, T., Dwyer, C.A., Yoshida-Tanaka, K. et al. Cholesterol-functionalized DNA/RNA heteroduplexes cross the blood–brain barrier and knock down genes in the rodent CNS. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-00972-x