Nature解答Cas9基因組編輯核心謎題

　　有一種蛋白在細菌免疫系統中起著至關重要的作用，并正快速成為一種很有用的遺傳工程工具。現在有關這一蛋白的一個中心問題已經獲得了解答。來自勞倫斯伯克利國家實驗室和加州大學伯克利分校的研究人員，確定了這一叫做Cas9的細菌酶在病毒感染過程中是如何在RNA序列的引導下識別和降解外源DNA，以及在動物和植物細胞中誘導位點特異性遺傳改變的。通過結合單分子成像和大量的生化試驗，該研究小組證實Cas9的基因組編輯能力是通過稱作為“PAM”( protospacer adjacent motif)的短DNA序列來實現的。

　　該研究的領導者、生物化學家Jennifer Doudna 說：“我們的研究結果揭示了PAM的兩個主要功能，解釋了它對于Cas9能夠靶向和切割與導向RNA相匹配的DNA序列如此至關重要的原因。在外源DNA的靶向位點附近存在PAM，而宿主基因組的這些靶向位點則缺乏PAM，使得Cas9能夠精確區分必須降解的非自身DNA和幾乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要條件。”

　　隨著基因工程微生物，例如細菌和真菌，在綠色化學生產有價值的化學產品，包括治療藥物、高級生物燃料和生物降解塑料中發揮越來越大的作用，Cas9正在成為合成生物學從業者一種重要的基因組編輯工具。

　　Doudna說：“了解Cas9如何能在數百萬到數十億堿基對長的基因組中找出特異的20個堿基對的靶序列，或許能夠改進在細菌和其他細胞類型中的基因靶向和基因組編輯工作。”

　　細菌微生物面臨著來自病毒和稱作為質粒的侵入核酸片段無休止的攻擊。為了生存，微生物利用了一種基于核酸、以CRISPR遺傳原件為中心的適應性免疫系統。通過結合CRISPRs和RNA導向的內切核酸酶，例如Cas9，細菌能夠利用專門的小crRNA分子，引導靶向及降解侵入病毒和質粒中的匹配 DNA序列阻止它們復制。CRISPR–Cas免疫系統有三種不同的類型。Doudna和她的研究小組將焦點放在了II型系統上，其獨特地依賴于RNA編程Cas9在靶位點上切割雙鏈DNA。

　　論文的主要作者、Doudna 研究組成員Samuel Sternberg 說：“Cas9和RNA導向的相似復合物是如何在整個基因組中找出并識別匹配的DNA靶點，一直以來是CRISPR–Cas領域的一個大謎題，這是一個經典的大海撈針的問題。所有正在開發RNA可編程Cas9實現基因組操作的科學家們，都依賴于它能夠在細胞內靶向獨特的20個堿基對序列的能力。然而，如果 Cas9只是在整個基因組的一些隨機位點盲目地結合DNA直至撞到它的靶DNA，那這個過程將會非常費時，它有可能無法有效地實現細菌免疫，或成為一種基因組操作工具。我們的研究表明，Cas9是通過首先尋找PAM序列來確定它的搜索范圍。這加速了定位靶DNA的速度，最大限度地縮小了解讀非靶向DNA位點的時間。”

　　Doudna、Sternberg和同事們利用一種獨特的DNA窗簾分析法和全內反射熒光顯微術(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)，在Cas9結合與解讀DNA之時對單個Cas9進行了實時成像。DNA窗簾技術提供了前所未有的、關于Cas9靶點搜尋過程機制的一些新認識。采用傳統的大量生物化學檢測驗證了成像的結果。

　　Sternberg 說：“我們發現Cas9只在識別PAM后才利用RNA–DNA堿基配對來解讀DNA尋找匹配的序列，這樣避免了意外地靶向細菌自身基因組中的匹配位點。然而，即使Cas9以某種方式與自身基因組中的一段匹配序列錯誤地結合，沒有PAM也無法觸發催化核酸酶的活性。利用這種DNA解讀機制，PAM提供了兩個冗余的檢查點，確保Cas9不會錯誤地破壞它自身的基因組DNA。”