Nature子刊m6A修飾攜手miRNA揭示脫氧膽酸在膽囊癌中作用機制的應用
miRNAs是一類長約22nt的單鏈小RNA，已經成為多種疾病的關鍵調控分子。大量研究表明miRNA參與調節生物體內分子過程以及各種疾病的發生過程，但針對m6A甲基化修飾是否會對miRNA調節疾病相關過程產生影響的研究卻微乎其微。為了解答這一問題，云序客戶通過高通量測序以及多種分子機制研究手段對m6A影響miRNA分子機制的研究進行了揭示，并且在oncogene上發表了相應的研究成果（Deoxycholic
acid modulates the progression of gallbladder cancer through
N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation），本文結合本文結合meRIP, miRNA-seq,qPCR等多種技術，揭示了脫氧膽酸可能在膽囊癌中發揮作用，為膽囊癌提供了一種新的診治策略。
發表期刊：Oncogene
影響因子：7.971
實驗方法: miRNA-seq ，m6A-meRIP-qPCR，雙熒光素酶實驗
文章鏈接：Deoxycholic acid modulates the progression of gallbladder cancer through N6-methyladenosine-dependent microRNA maturation
研究內容
(1) 人GBC標本中血清DCA水平分析
越來越多的證據表明，BA穩態的失衡是疾病的主要特征，因此作者對正常人和GBC患者的血清進行BAs檢測，結果發現，與正常個體不同，GBC患者中大多數血清BA水平明顯升高(圖1a)，這表明BAs穩態被明顯破壞，并可能影響疾病的發生和進展。與之相反，DCA（一種繼發性游離性BA）被發現在GBC患者中明顯降低。此外，與GBC相比，膽囊腺瘤(GA)是一種侵襲性較弱的膽囊疾病，其血清中DCA水平較高(圖1b)，表明DCA下調水平依賴于癌癥表型。這些發現顯示DCA可能是一種新的GBC診斷生物標志物。
為了探討使用血清DCA作為GBC患者診斷生物標志物的可能性，作者評估了受試者工作特征(ROC)曲線。作者發現血清DCA水平的ROC曲線下面積為0.87，高于CA19-9（常規診斷生物標志物）的ROC曲線0.71。此外，血清DCA水平越低，GBC越具有侵襲性，表現為腫瘤塊更大且Ki-67表達更強(圖1d,
e)。因此，血清DCA水平可能是GBC的潛在診斷生物標志物。
并且，DCA水平下降的GBC患者總體生存率較差。此外，單因素回歸分析顯示，GBC患者的肝臟侵襲性、腫瘤大小、TNM分期、遠程轉移、淋巴結轉移、T分類和血清DCA水平均與生存期密切相關(圖1g)。多因素回歸分析顯示DCA可作為GBC患者預后診斷分子標志物。綜上研究結果顯示，DCA在GBC患者中表達下調，且與不良臨床結果相關，可將DCA確定為GBC的潛在生物標志物。
(2) DCA在GBC細胞中具有抑瘤作用
近期研究表明，BAs在某些腫瘤中積累可減緩腫瘤增殖說明BAs可能具有抑癌作用。由于膽囊BAs與血清BAs密切相關，作者測定了DCA在膽囊的濃度范圍。然后，作者測定了三種人GBC細胞株中DCA濃度范圍在nM到
μM范圍內的細胞存活率，發現三種GBC細胞的細胞活力在μM范圍內均受到影響。為確定DCA是否對GBC發展產生影響，作者在體外通過不同濃度的DCA對NOZ和GBC-
SD兩種人GBC細胞系的生物學行為進行了評估。DCA處理明顯降低GBC細胞活力，且呈劑量依賴性(圖2a)。接下來，作者研究了DCA是否影響GBC細胞的增殖。增殖實驗結果顯示，DCA處理明顯減少NOZ和GBC-
SD細胞的增殖(圖2b)，說明DCA可能減緩GBC腫瘤細胞的生長。集落形成試驗表明，DCA處理后，NOZ和GBC-SD細胞的集落數量明顯減少(圖2c)。作者進一步研究了DCA對裸鼠GBC移植瘤生長的影響。通過皮下注射GBC癌細胞給小鼠，然后喂食含有0.1%
DCA的飲食或等量的載體。與對照組(vehicle)相比，DCA治療組腫瘤生長速率(圖2d,
e)和腫瘤重量(圖2f)均明顯降低。此外，Ki-67免疫染色對來自不同小鼠的腫瘤的組織病理學分析顯示，DCA治療組的增殖率低于對照組(圖2
g)。綜上所述，體內外實驗結果表明，DCA對GBC具有抑瘤作用。
(3) DCA降低GBC細胞中miR-92b-3p的表達
作為一種非編碼RNA，miRNAs已經成為癌癥的關鍵調控分子。作者進行了高通量miRNA-seq檢測，發現DCA處理的NOZ細胞中有26個miRNA的表達與vehicle處理的相比存在明顯差異。分析結果顯示，在DCA處理后，17個miRNA下調，更小的miRNA被上調(圖3a)。對上述處理的NOZ和GBC-SD細胞進行PCR
(qPCR)分析顯示在下調的miRNA中，下調較明顯的是miR-92-3p
。此外，GBC細胞中miR-92b-3p的表達也受DCA劑量依賴性的減少(圖3c)。為了進一步探究miR-92b-3p在GBC細胞中的作用，作者建立了穩定過表達miR-92b-3p的NOZ和GBC-
SD細胞系，發現miR-92b-3p明顯增強了細胞的增殖。miR-92b-3p的異位表達部分減弱了DCA介導的腫瘤生長減緩。此外，作者也分析了miR-92b-3p在手術切除旁組織和GBC組織標本中的表達水平，發現miR-92b-3p在組織中的表達高于旁組織。這些結果顯示miR-92b-3p可能參與了疾病進展的不同階段，并可能導致較差的臨床結果。
為了驗證該項假設，作者通過數據庫研究miR-92b-3p的表達是否與GBC的預后密切相關。然而，在TCGA中沒有發現miRNA表達與GBC存活時間的關系，可能是由于樣本量小。但作者也發現，miR-92b-3p的高表達與較短的生存時間明顯相關。因此，作者測量了miR-92b-3p在GBC組織樣本中的表達，結果顯示過表達miR-92b-3p的GBC患者總生存時間較低表達miR-92b-3p的患者短。這些數據表明，miR-92b-3p是GBC的一種新的致癌因子，DCA可能通過控制GBC細胞中miR-92b-3p的表達而發揮減少因子的作用。
