Nature子刊：發表生物分子凝聚體研究指南

在真核細胞中，生物大分子通過相分離組裝形成功能各異的無膜細胞器（MLOs），使得細胞區域化，從而實現對各種生理活動的精細時空調控。隨著相分離在生命科學領域逐漸受到重視，越來越多的研究系統揭示了無膜細胞器的多種生物功能和形成機制。目前領域內仍然有很多問題亟待解決，其中最關鍵的是如何在體內定義相分離，以及如何建立相分離現象和生物學功能之間的邏輯關系。

生命學院吝易課題組主要利用生化、細胞及神經生物學手段，建立體內外研究模型，系統性地解析細胞內無膜細胞器亞細胞結構形成的特異性以及分子機制；探索生物大分子相分離對神經系統的重要生理意義；并通過人工干預的手段調控病理狀態下的異常相變，最終達到治療神經退行性疾病的目的。

文章首先闡釋了相分離的分子機制。無膜細胞器中通常富集了多種組分，其作用不盡相同，因此需要分辨哪些成分是對相分離形成和結構維持不可或缺的支架蛋白；哪些是被招募的配體蛋白。作者隨后著重討論了支架蛋白發生相分離的三種主要分子驅動力：具有良好折疊結構的串聯重復結構域之間的多價相互作用、低復雜度結構域多聚組裝、以及二者的共同作用。此外，目前已開發出多種基于氨基酸序列特征預測蛋白質相分離潛力的計算工具，文章也對此類工具原理與局限性進行了簡要討論。作者進一步歸納了體內與體外相分離現象相關實驗中的一些注意事項：① 相分離是高度計量依賴的現象，系統臨界濃度受環境因素（如溫度、鹽濃度、壓力、pH等）的影響，因此需要盡量詳細的體外和體內相圖來反映在細胞中的相分離能力。并且在體外系統中，研究者應警惕使用擁擠劑（如聚乙二醇）可能帶來的假象。② 為進一步觀察生理狀態下的無膜細胞器，應利用免疫熒光染色或內源標記等手段進行研究，并鑒定其與已知膜細胞器之間的關系。為了防止假陽性結果，需要謹慎評估抗體的特異性，以及熒光標簽對蛋白質相分離能力的影響。③ 無膜細胞器具有豐富的生物物理特性，因此對其分子擴散能力、大小與形態的表征，有助于鑒別細胞內不同的相分離體系。④ 多價相互作用是相分離的基礎，因此除了對相分離現象的描述外，也需剖析其中支架蛋白多價互作的分子機制。作者特別強調一個常見誤區，即低復雜度結構域于相分離既非必要也非充分。

無膜細胞器通過精細的時空分布執行其生物學功能，文章對目前報道的不同功能類型進行了總結歸納：① 組成型的凝聚體穩定存在，通常參與維持基本生命活動；② 細胞信號通路中的凝聚體則具有高度動態性，接收細胞內部或外部信號后在特定位置出現并調控下游生理反應；③ 細胞應激時迅速形成或解離的凝聚體，反映出細胞對溫度、pH、氧化還原和滲透狀態等不利條件的適應機制。最后，文章總結了如何設計實驗將相分離與其生物學功能建立關聯。首先，在體內觀察無膜細胞器時，應留意其出現的時序與細胞定位。為進一步剖析無膜細胞器的形成與作用機制，可以對其組分進行分析。常見的無膜細胞系分離方法包括離心、鄰近標記、分選及大規模基因篩選等。此外，也可以通過如液滴共沉淀（Liquid-droplet pelleting）或水凝膠捕獲（Hydrogel trapping）等體外重組技術研究無膜細胞器的組成特異性。為證明相分離對生物學功能的充要性，需要構建破壞相分離能力的突變體，利用小分子（如1,6-己二醇）解聚凝聚體，更重要的是利用分子嫁接（Molecular grafting）或光誘導系統調控相分離，建立相分離與生物功能之間的因果關系。

綜上，本文系統闡釋了相分離的分子機制、梳理了相分離的研究方法，探討了如何建立相分離現象和生物學功能之間的邏輯關系，同時總結了一些相分離研究中的常見誤區，希望為更多的研究人員探究生命科學中的相分離現象提供參考。

相分離研究的簡要實驗路線

該文章于2022年11月19日在《自然化學生物學》（Nature Chemical Biology）上以觀點形式發表，題為“相分離生物分子凝聚體簡要研究指南”（A brief guideline for studies of phase-separated biomolecular condensates）。清華大學生命科學學院吝易助理教授與李丕龍副教授為本文的共同通訊作者，清華大學生命科學學院2016級博士研究生郜一飛與2020級博士研究生李蹊為本文共同第一作者。兩實驗室分別得到清華-北大生命科學聯合中心、清華-IDG/麥戈文腦科學研究院、北京結構前沿研究中心的支持。