基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted
laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF
MS)是20世紀80年代發展起來的一種新型軟電離有機質譜, 作為一種新興的蛋白質組學檢測技術,
現已廣泛應用于生命科學及相關領域。同時作為一項新興的微生物鑒定技術, 受到了國內外的廣泛關注。與傳統的生化表型鑒定方法和分子生物學方法相比,
MALDI-TOF MS具有操作簡單、快速、準確和經濟的特點。早在1975年,
ANHALT等[1]利用質譜儀結合高溫裂解技術第1次完成了細菌的鑒定, 從此拉開了質譜鑒定細菌的“ 序幕” 。隨著質譜檢測技術的不斷完善和發展,
近年來, MALDI-TOF MS已經成功應用于微生物的鑒定, 顯示了其在細菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應用價值。眾多的研究表明,
MALDI-TOF MS技術對培養出的純菌落進行菌種鑒定具有很高的穩定性及準確性, 對常見細菌和酵母菌的屬的鑒定率能達到97%~99%,
種的鑒定率也能達到85%~97%; 另外, MALDI-TOF MS大大縮短了細菌鑒定的時間, 而且其成本也較常規鑒定方法低[2,
3]。除此之外, MALDI-TOF MS已經能夠成功地用于部分微生物亞種水平的鑒定和細菌耐藥性的檢測,
但這種方法在大多數情況下是應用于培養出的純菌落的鑒定[3]。
如果能夠從臨床樣本中直接檢測細菌/真菌,
突破細菌/真菌培養陽性率低、培養時間長的瓶頸, 為細菌/真菌感染性疾病的診療提供更快、更準確的病原學依據,
將對臨床及時控制細菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。國內外學者已嘗試將質譜技術應用于臨床樣本的直接檢測,
并取得了顯著的進展。本文就MALDI-TOF MS技術在臨床樣本的直接檢測應用作一綜述。
一、MALDI-TOF MS檢測原理
MALDI-TOF
MS技術用于微生物鑒定的實質就是檢測具有屬、種或亞型特異性的生物標志的質量信號,
主要是微生物菌體內高豐度、表達穩定和進化保守的核糖體蛋白。MALDI-TOF MS
儀器主要由基質輔助激光解吸離子源(MALDI)和飛行時間質量檢測器(TOF)兩部分組成。MALDI的原理是用一定強度的激光照射樣本與基質形成的共結晶薄膜,
基質從激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使樣本分解吸附, 基質和樣本之間發生電荷轉移從而使樣本分子發生電離;
TOF的原理是帶有電荷的樣本分子在電場作用下加速飛過飛行管道, 因為離子的質荷比與離子的飛行時間呈正比,
所以不同質量的離子因達到檢測器的飛行時間不同而被檢測,
以離子峰為縱坐標、離子質荷比為橫坐標形成特征性的質量圖譜。將不同種屬微生物經MALDI-TOF分析所形成的質量圖譜與數據庫中的參考圖譜進行比較,
從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定[2]。
二、MALDI-TOF MS直接檢測臨床樣本的流程
臨床樣本直接檢測的流程主要包括3個部分:臨床樣本的預處理、樣本上機檢測和對比蛋白質指紋圖譜數據庫得出鑒定結果。由于目前報道最多的臨床樣本是陽性血培養瓶和中段尿樣本, 下面將以這二者為例介紹其直接檢測的流程, 其它臨床樣本的檢測流程與之類似。
(一)臨床樣本預處理
MALDI-TOF
MS直接用于臨床樣本的檢測有2個基本的要求:(1)臨床樣本中細菌的量。為了得到準確的鑒定圖譜, MALDI-TOF
MS技術對置于靶板上的細菌的最低檢測限約為(1× 10^4)~(1×
10^6)cfu/mL。若要直接檢測擬似血流感染的血液樣本以及擬似泌尿系統感染的中段尿等臨床樣本中的病原菌, 首先必須富集細菌;
(2)臨床樣本的質。由于血液和血培養瓶中的大分子成分如血紅蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白細胞等有機成分會干擾細菌的譜峰,
所以直接檢測前需要采取預處理措施去除這些干擾因素。
1.陽性血培養瓶直接檢測
直接檢測陽性血培養瓶的細菌濃度常常需要1× 10^7 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的細菌量常常很低(最低可<
1~10 cfu/mL), 因此對血樣本的直接檢測需要一個增菌的過程, 即采用血培養瓶增菌。目前已報道的陽性血培養病原菌預處理程序各不相同,
但預處理過程主要包含了以下2個步驟:(1)將細菌從血細胞中分離出來。先應用溫和去污劑(如吐溫-80、十二磺基硫酸鈉、皂素等)將血液中的血細胞溶解,
然后通過不同的流程(離心、洗滌)去除其它的干擾因素, 純化要鑒定的細菌樣本; (2)將菌體中的蛋白質抽提出來。最常用的是混合溶劑處理法,
使用甲酸/乙腈溶液對樣本進行處理來抽提蛋白, 利用2種溶劑的混合作用將菌體表面的蛋白和存在于細胞內的低相對分子質量的高豐度蛋白提取出來,
實現對菌株的鑒定。雖然至今尚沒有規范化的處理程序, 不過目前市場上已有商品化的陽性血培養瓶預處理試劑盒Sepsityper
kit(Bruker)可以提高鑒定分數和鑒定準確率, 但是花費比較高, 處理程序也費時較長[5]。另外, HAMMARSTR?
M等[6]建立了一種基于聲學捕捉和集成選擇性富集目標(integrated selecive enrichment target,
ISET)的新方法用于富集樣本中的細菌, 快速、準確并且簡化了人工操作, 有望替代傳統的以離心為基礎的分離方法。
2.中段尿樣本
要取得一個較高的鑒定成功率, 直接檢測中段尿樣本中病原菌至少需要的細菌數量是1× 10^5 cfu/mL[7,
8]。對尿樣本的預處理程序較為簡單, 主要有下面幾個步驟:低速離心去除白細胞, 高速離心收集細菌, 沉淀,
經過洗滌、離心之后進行蛋白質的提取(常用的是甲酸、乙腈), 經高速離心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室溫下干燥后即可進行檢測。
(二)MALDI-TOF MS分析
目前主要有4種MALDI-TOF
MS系統[9]:MALDI Biotyper系統 (Bruker Daltonics, 德國), VITEK MS系統 (BioMé
rieux, Marcy l’ Etoile, 法國), the AXIMA@SARAMIS 數據庫 (AnagnosTec, 德國)和the
Andromas (Andromas, 法國), 其中前2種質譜系統已獲得中國食品和藥品監督管理局許可證, 可以用于臨床樣本的檢測。
在進行質譜分析前,
應根據不同的檢測對象和使用的激光類型選擇合適的基質。基質由基質復合物和基質溶劑組成。常用溶劑有:乙醇、乙腈和一種強酸如三氟乙酸、甲酸等。常用的基質是2,
5-二羥基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoic acid, DHB)、ɑ -氰基-4-羥基肉桂酸(ɑ
-cyano-4-hydroxycinnamic acid, ɑ -CHCA)、3, 5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sinapinic
acid, SA)等。將經過提取的微生物樣本細胞內容物與等量的基質溶液(通常是1 μ L)混合或分別點加在樣本靶板上,
待室溫條件下干燥后(使得樣本與基質共結晶)上機檢測即可。
(三)鑒定結果分析
將質譜檢測得到的譜峰與數據庫進行模式匹配,
得到一個鑒定分數。基于軟件給出的在列表中第1種微生物的鑒定分數,
根據各自質譜分析系統的判斷標準得出檢測結果。目前文獻報道有2種判斷標準:第1種是由STEVENSON等[10]提出的,
鑒定結果按照匹配程度進行打分, 分值在0~3之間。當得到的鑒定分數≥ 2.0時, 表示待測菌株有較大的把握被鑒定到種的水平;
鑒定分數在1.7和2.0之間時, 表示菌株被鑒定到屬的水平, 分值< 1.7表示產生的鑒定結果不可信。第2種標準是LA
SCOLA等[11]提出的, 當一個樣本經過4次點樣鑒定, 當列表中第1種微生物的鑒定結果均一致, 并且至少2次的鑒定結果鑒定分數≥
1.900, 或者4次的鑒定分數均≥ 1.200, 表明微生物能被正確鑒定。有學者發現通過改進上述的鑒定標準可以得到更好的鑒定效果,
ROSSELLó 等[12]認為在臨床樣本直接鑒定時, 鑒定分數要比直接純培養的低, 可能會對分析結果造成干擾, 而廠商推薦的鑒定標準有些嚴格,
只有得到很高的鑒定分數結果才是被接受的。因此提出新的標準增加可接受的準確鑒定數:當一個樣本4次點樣中至少有2次的鑒定結果一致,
并且對列表中的第1個微生物種的鑒定分數均≥ 1.4時, 即表示能夠準確鑒定,
這種標準與純培養的鑒定結果有100%的符合率。NONNEMANN等[5]、GORTON等[13]將種的鑒定分數降到1.5,
可以將種的鑒定率從56%提升到76%、54%提升到63%。以上均提示了廠商推薦的cut-off值比較保守, 使得鑒定的敏感性降低。此外,
由于目前的數據庫尚不完善, 對于部分菌株可能會出現鑒定失誤的情況, 實驗室工作人員應在商品數據庫的基礎上建立和豐富自己的參考數據庫,
以提升鑒定的準確率。