Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modiWed
skin-fold chamber model
Stephanie Alexander · Gudrun E. Koehl ·Markus Hirschberg · Edward K. Geissler · Peter Friedl
Accepted: 13 October 2008 / Published online: 6 November 2008
摘要：從首次感染部位向鄰近基質的轉移入侵是腫瘤發展過程中的關鍵步驟，研究成果較少。腫瘤入侵的原理以各種體外模型給出了實驗性的表述；但是，體內的關鍵性步驟和機制仍然不清楚。這里，我們通過落射熒光成像和多光子顯微鏡建立了一個修正的皮膚折疊室模型來闡述關于HT-1080纖維肉瘤細胞的原位移植，生長和入侵。這種策略允許對作為獨立細胞或者集體粘絲或者細胞團沿著富含膠原的細胞外基質和增補宿主組織包括紋狀肌肉絲和淋巴管的腫瘤生長、腫瘤誘導血管形成和入侵進行重復成像。這個修正的窗口模型將適用于闡述腫瘤轉移和入侵的機制，以及相關的實驗性治療。
材料與方法
HT-1080雙色纖維肉瘤細胞表達細胞質DsRed2和核組蛋白2B（H2B）-EGFP –EGFP (Yamamoto et al. 2004)培養在改良的鷹培養基(PAN Biotech GmbH, Aidenbach, Germany)中，補充10%的胎牛血清(Aurion, Wageningen, The Netherlands)，盤尼西林和鏈霉素（都100ug/ml;PAN)和潮霉素B（0.2mg/ml；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在37%濕潤的5%CO2的培養環境中。
對于多光子顯微鏡，小鼠被用異氟烷麻醉并被穩定固定在37℃的溫控平臺上。使用一個落射多光子顯微鏡，如(Friedl et al. 2007; Wolf et al. 2003)所描述，并配備了OPO裝置(OPO; APE, Berlin, Germany)用于1100nm波段的雙光子激發，以及紅外修正的20X/0.95N.A(Olympus)物鏡。如果沒有特定聲明，EGFP，DsRed2和SHG的獲取都是使用的832nm的激發光。由帶通濾波器確定的檢測光波段為400/40(藍），535/50（綠），605/70（紅），和710/75（紅外）。以5um的步長對深達250um的成像深度進行順序3D堆棧。通過向尾靜脈注射4mg熒光葡聚糖對血管顯影。在注射了淋巴歸巢環肽LyP-1（100ug）之后活化的淋巴管被檢測到。(Laakkonen et al. 2002)
圖像被使用ImageJ 1.40 g (W. Rasband, NIH), ImSpector 3.4 (LaVision Bio- Tec GmbH), and Photoshop CS 8.0.1 (Adobe Systems Inc.)重構和分析。以寬的平方X長Xπ/6計算腫瘤體積。有絲分裂和細胞凋亡的比例通過H2B-EGFP模式從每區域30到100個細胞中確定。
主要結果
Fig.1 在背側皮膚褶皺室中HT-1080纖維肉瘤細胞的滴落和注射方法比較.6（c）、7（d）天后通過明場和落射熒光顯微鏡觀察的細胞應用，生長位置（a，b）和宏觀腫瘤形態。在建立的模型中，允許細胞懸浮液或者細胞球粘附到外科手術準備好的真皮組織表面上，獲得了在真皮層與蓋玻片（a.c）間的3D腫瘤生長。使用細針將細胞球注射進真皮中阻止蓋玻片和真皮內產量增加間的反應（b,d)。標尺1mm（概圖）和250um（細節）