JenniferDoudna：除了基因編輯，CRISPR還能做什么？

Jennifer A. Doudna（左）

　　很少有發現能夠像CRISPR那樣在一夜之間改變整個領域。CRISPR-Cas原本是原核生物的適應性免疫系統，自從人們發現了Cas9的應用潛力，這一系統迅速成為了炙手可熱的基因組編輯工具。加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna在本期Molecular Cell雜志上發表文章，全面探討了CRISPR-Cas9在各方面的應用。Doudna是CRISPR技術的共同開發者，曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”（Breakthrough Prize），也是CRISPRZL的有力競爭者。

　　CRISPR-Cas9基因組編輯

　　人們發現Cas9的分子功能之后，很快開始用Cas9和sgRNA編輯基因組。CRISPR-Cas9讓以往費時費力的基因組編輯變成了一件非常容易的事。

　　引入插入/缺失

　　Cas9在sgRNA的引導下，靶標目的位點并誘導雙鏈斷裂DSB，細胞通過NHEJ（non-homologous end-joining）將其修復。NHEJ是一個容易出錯的修復通路，會產生插入/缺失（indel）破壞開放閱讀框，導致基因失活。CRISPR-Cas9在這方面的編輯效率可以高達80%。

　　精確的改變

　　HDR（homology-directed repair）可以讓CRISPR-Cas9的基因組編輯更加精確。將Cas9-sgRNA與供體DNA結合起來，細胞就能用供體DNA作為模板來修復DSB。這一策略可以向目的基因引入新序列或者特定突變，模擬或者矯正致病性的等位基因。不過HDR的效率顯著低于NHEJ。

　　染色體重排

　　用CRISPR-Cas9對模式生物進行基因組編輯已經常規化了，人們又發現了一些更有趣的應用。舉例來說，同時表達Cas9和多種sgRNA可以實現多重化靶標。除了同時編輯多個染色體位點以外，CRISPR-Cas9還可以刪除染色體大片段，這需要兩個sgRNA在目標區域兩側誘導DSB。此外，CRISPR-Cas9還可以模擬腫瘤中發生的大規模的染色體重排。

　　CRISPR-Cas9高通量篩選

　　最近有不少研究利用CRISPR-Cas9的可編程特性進行全基因組篩選。比如說，用慢病毒sgRNA文庫和催化活性的Cas9可以在人類和小鼠細胞中進行功能缺失的基因敲除篩選。這樣的篩選可以揭示細胞生存的必需基因，以及涉及特定藥物抗性的基因。

　　失去催化活性的Cas9 (dCas9)也可以用來進行全基因組篩選，它可以直接上調或者下調基因表達。與生成indel的活性Cas9相比，在某些情況下dCas9的轉錄沉默能夠更有效的阻斷基因表達。不過dCas9在這方面的最大優勢是，介導轉錄激活子的招募，進行功能獲得性篩選。

　　dCas9調控基因表達

　　通過點突變失活Cas9的催化活性位點，就會得到dCas9。dCas9依然可以在RNA的引導下，實現可編程的DNA結合。人們利用這一點開發了調控基因表達的新工具。

　　dCas9與sgRNA一起在細菌中表達，可以阻止RNA聚合酶與啟動子結合，下調特定轉錄本的表達。人們還將dCas9與特定的效應子結構域融合起來，將轉錄抑制因子或轉錄激活因子招募到特定的基因組區域，在真核生物中實現更強的基因表達控制。除此之外，將dCas9與帶有表觀遺傳學標簽的效應子結構域融合，還可以特異性的干擾表觀遺傳學調控。

　　dCas9的其他用途

　　dCas9還有一些其它的用途：dCas9與GFP融合能夠在活細胞中成像DNA位點，進一步揭示基因組特定位置的動態和結構。人們還可以通過dCas9介導的轉錄調控構建穩固的基因回路，這對于合成生物學來說非常實用。最近還有研究表明dCas9可以結合單鏈RNA，這意味著在不久的將來人們有望對RNA轉錄本進行編程操作。

　　提高CRISPR-Cas9特異性

　　為了減少CRISPR-Cas9的脫靶效應，人們開發了一系列策略。研究者們用成對的sgRNA引導Cas9切口酶變體，在sgRNA結合的地方造成單鏈切口（SSB），兩個相鄰的單鏈切口會形成一個DNA雙鏈斷裂（DSB）。而單個sgRNA造成的SSB能通過堿基切除修復得到精確修復，不引入插入或缺失突變。

　　研究者們還對Cas9進行了基因工程改造，讓其依賴二聚化才能酶切，就像鋅指核酸酶（ZFN）和TALEN那樣。研究顯示，dCas與Fok1核酸酶融合之后，DSB形成依賴于FokI的二聚化。二聚化酶對序列的要求更為嚴格，可以大大減少脫靶位點的數量。Cas9-FokI單體無法進行酶切。

　　人們還發現，適當截短sgRNA可以減少脫靶事件，同時不犧牲正確編輯的效率。只需要縮短gRNA靶標區域的長度，就可以使脫靶突變大幅減少。研究表明，17/18個核苷酸的靶向區域能夠比全長gRNA更有效地靶向預定序列。

　　CRISPR-Cas9的未來

　　CRISPR-Cas9在醫療領域有著廣闊的前景，可以用來矯正致病突變，治療人類疾病。研究者們也在嘗試用這一技術操縱生態群體，比如根據毒力或者抗性基因殺死相應的細菌、快速改變種群性狀、控制入侵物種、改良主要農作物等等。此外，CRISPR-Cas9還有著很大的潛力，可以被改造為更強大的研究工具。Doudna指出，這一技術將帶領生物學研究進入一個新的時代。