GB／T189792003食品中黃曲霉毒素的測定（二）

取樣品洗脫液1.0mL加入重蒸餾水定容至2.0mL，用進樣器吸取100mL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定試樣的響應值（峰高或峰面積）。經過與黃曲霉毒素標準液譜圖比較響應值得到試樣中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的濃度 。

2.4.4 空白試驗

    用水代替試樣，按2.4.1~2.4.3步驟做空白試驗。

2.4.5 結果計算

檢測結果按公式（1）計算：

                        …………（1）

式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B₁、B₂、G₁或G₂）的含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 空白試驗黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終凈化洗脫液所含的試樣質量，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。

    黃曲霉毒素總量為B₁、B₂、G₁、G₂個別濃度之和，即B₁+B₂+G₁+G₂。

注：計算結果需扣除空白值。

計算結果表示到小數點后2位。

3 免疫親和層析凈化熒光光度法

3.1 方法提要

試樣經過甲醇-水提取，提取液經過濾、稀釋后，濾液經過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂具有專一性，黃曲霉毒素交聯在層析介質中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素（B₁+B₂+G₁+G₂）總量。

3.2 試劑和溶液

3.2.1甲醇（CH₃OH）：色譜純

3.2.2甲醇-水（7+3）：取70mL甲醇加30mL水

3.2.3 甲醇-水（8+2）：取80mL甲醇加20mL水

3.2.4甲醇-水（45+55）：取45mL甲醇加55mL水

3.2.5 苯：色譜純         不要去掉

3.2.6乙腈：色譜純

3.2.7苯-乙腈（98+2）：取2mL乙腈加98mL苯

3.2.8氯化鈉（NaCl）

3.2.9磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄）

3.2.10磷酸二氫鉀（KH₂PO₄）

3.2.11氯化鉀（KCl）

3.2.12  溴溶液儲備液（0.01%）：稱取適量溴，溶于水，配成0.01%的儲備液，4℃避光保存。

3.2.13  溴溶液工作液（0.002%）：取10mL 0.01%的溴溶液加入40mL水混勻，于棕色瓶中保存備用。需每次使用前配制。

3.2.14      二水硫酸奎寧（C₂₀H₂₄N₂O₂×H₂SO₄×2H₂O）

3.2.15  硫酸溶液（0.05mol/L）：取2.8mL濃硫酸，緩慢加入適量水中，冷卻后定容至1000mL。

3.2.16  熒光光度計校準溶液：稱取3.40g硫酸奎寧（C₂₀H₂₄N₂O₂×H₂SO₄×2H₂O）用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至100mL，此溶液熒光光度計讀數相當于20 mg/L黃曲霉毒素標準溶液。

3.3 儀器和設備

3.3.1 熒光光度計

2.3.2 高速均質器：18,000 r/min ~22,000 r/min。

2.3.3 黃曲霉毒素免疫親和柱。

2.3.4 玻璃纖維濾紙：直徑11cm，孔徑1.5μm。

2.3.5 玻璃注射器：10 mL，20mL。

2.3.6 玻璃試管：直徑12 mm ，長75mm，無熒光特性。

2.3.7 空氣壓力泵。

3.4 分析步驟

3.4.1提取

同本標準2.4.1。

3.4.2 凈化

同本標準2.4.2。

3.4.3測定

3.4.3.1    熒光光度計校準

    在激發波長360nm，發射波長450nm條件下，以0.05mol/L硫酸溶液為空白，調節熒光光度計的讀數值為0.0 mg/L；以熒光光度計校準溶液（3.2.16）調節熒光光度計的讀數值為20.0 mg/L。

3.4.3.2    樣液測定

取上述凈化后的甲醇洗脫液加入1.0mL 0.002%溴溶液，混勻，靜置1min，按3.4.3.1條件進行操作，于熒光光度計中讀取樣液中黃曲霉毒素（B₁+B₂+G₁+G₂）的濃度 （mg/L）。

3.4.4空白試驗

用水代替試樣，按3.4.1~3.4.3步驟做空白試驗。

3.4.5結果計算

檢測結果按公式（2）計算：

                        …………（2）

式中： — 試樣中黃曲霉毒素（B₁、B₂、G₁或G₂）含量，mg/kg；

      — 試樣中黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 空白試驗黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁或G₂的含量，mg/L；

      — 最終甲醇洗脫液體積，mL；

      — 最終凈化洗脫液所含的試樣質量，g；

      — 試樣稱取量，g；

      — 樣品和提取液總體積，mL；

      — 稀釋用樣品濾液體積，mL；

      — 稀釋液體積，mL；

      — 通過親和柱的樣品提取液體積，mL。注：計算結果需扣除空白值。

        計算結果表示到小數點后1位。